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炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的人畜共患的烈性传染病,在世界范围内具有广泛的分布。按照感染途径不同,可以分为皮肤炭疽、胃肠炭疽、肺炭疽和注射炭疽4种,其中肺炭疽的致死率高达90%,我国将其按甲类传染病进行预防和控制。炭疽芽孢是一种潜在的生物战剂和生物恐怖剂。炭疽芽孢杆菌的毒力因子包括两个方面:聚-D-谷氨酸荚膜和炭疽毒素。其中荚膜能够阻止细菌被吞噬细胞吞噬,毒素则包括保护性抗原（protective antigen,PA）、致死因子（lethal factor,LF）和水肿因子（edema factor,EF）三种蛋白,单独都不致病,PA+LF组成的致死毒素（lethal toxin,LT）,PA+EF组成的水肿毒素（edema toxin,ET）是导致宿主死亡的主要原因。PA通过与靶细胞表面的受体结合后,介导LF和EF进入细胞发挥毒性作用,阻断PA输送LF和EF到细胞内是抗炭疽的重要机制之一。炭疽的防控主要包括预防和治疗两个方面。疫苗是炭疽预防的有效手段,但在接种的短时间内无法起作用。所以针对可能由炭疽导致的突发的生物恐怖,抗炭疽抗体作为紧急预防的手段逐渐被人们所认识。而在炭疽的治疗方面,现阶段的治疗策略主要有抗生素和治疗性抗体两种。抗生素能够有效对抗敏感的炭疽芽孢杆菌,但不能清除体内的炭疽毒素。而治疗性抗体不仅对炭疽芽孢杆菌有效,而且能够有效中和炭疽毒素,降低毒素对宿主造成的损伤,提高存活率。5E11是本研究室前期研究获得的IgG1（κ）型抗PA人源化单抗,前期的研究结果显示5E11已经在细胞模型和毒素（LT）攻击大鼠模型中显示出良好的保护效果,需要更多的药物评价模型进一步评估5E11的治疗效力。相较于小鼠、大鼠等模型,家兔及猴模型更加接近人感染的真实情况。根据已有的文献报道,这两种模型均使用强毒株芽孢攻毒,需要在生物安全三级实验室（BSL-3）完成,条件受限,所以我们希望建立不依赖BSL-3的替代模型用于效力评价。但家兔和猴对弱毒株均不敏感,又鉴于炭疽致死毒素（LT）在引起机体损伤和宿主死亡中所起到的关键作用,我们选择建立炭疽致死毒素模型。在实验动物的选择上,我们使用家兔建模,相比于猴,具有成本较低,实验条件比较简单,操作方便等优点。由于炭疽致死毒素家兔模型还未见相关文献报道,我们希望在建模过程中,研究家兔对于炭疽毒素的敏感性,毒素攻击家兔的病理学过程,以及比较毒素模型和芽孢模型,研究毒素模型与芽孢模型的异同。进而使用毒素模型评价抗炭疽抗体的效力。在建模阶段,我们首先制备了足量PA和LF,使用不同剂量的PA和LF以2比1的质量比通过耳缘静脉注射攻击家兔,摸索致死条件,结果发现1 mg PA+0.5mg LF的致死毒素对家兔就有致死能力;当攻毒剂量提高到2 mg PA+1 mg LF时家兔全部死亡;当攻毒剂量达到4 mg PA+2 mg LF时该组10只家兔均在第2至3天死亡,死亡时间具有较好的一致性。其间我们观察了家兔出现的症状,包括活动能力下降、腹泻、呼吸窘迫、对刺激无反应等状况,其症状与芽孢攻毒相似。取死亡家兔的肝、肾、肺等器官进行病理学分析,发现高剂量攻毒组（4 mg PA+2mg LF）家兔的肝、肾、肺均有严重损伤,损伤包括出血、坏死、炎性细胞浸润等,与芽孢攻毒相似。而对体温的测量,则没有发现与芽孢攻毒相似的明显变化。对家兔血液中细胞因子的检测,检测到部分家兔在死亡前IL-4水平的明显升高。对比相关文献计算发现,毒素模型与芽孢模型感染的中后期相比,家兔血液中的PA峰值浓度在同一量级（104 ng/mL）,因此我们认为建立的毒素模型能够在一定程度上模拟芽孢感染中后期的情况。之后我们使用已经建立的炭疽致死毒素家兔模型对抗炭疽单抗5E11进行了效力评价。我们首先进行了5E11在家兔体内的药代动力学实验,测得5E11在家兔体内的平均半衰期约为1.5天。根据药代动力学数据我们设计了5E11的紧急预防实验,攻毒剂量为4 mg PA+2 mg LF,在攻毒前1天和4天耳缘静脉注射40 mg/kg的5E11能够提供完全保护,攻毒前7天预防不能提供保护。病理学分析比较了7天预防组和1天预防组家兔肝、肾、肺的病理变化,1天预防组较正常,7天预防组肝和肺均有损伤。以上结果显示出在同样给药剂量的情况下,预防给药时间越短效果越好。在5E11治疗效力评价部分,根据给药时间和给药剂量的不同设计了两个实验,使用4 mg PA+2 mg LF的剂量攻毒,攻毒后10 min注射40 mg/kg的5E11能够提供完全保护（5/5）,给药剂量减少至10 mg/kg能够提供80%保护（4/5）,减少至2.5 mg/kg能够提供60%保护（3/5）;而给药剂量40 mg/kg,延长给药时间至30 min有40%的存活率（2/5）,延长给药时间至60 min则只有20%的存活率（1/5）。病理学分析显示由于给药时间延长而死亡的家兔,其病理损伤比降低给药剂量更严重。毒素模型虽不同于芽孢模型,但其结果提示我们,感染中后期毒素大量积累时,如不及时清除毒素,将导致不可逆的损伤及宿主死亡。此外,对部分存活家兔使用毒素重复攻毒,结果没有家兔死亡,采血通过ELISA检测出了高水平的抗PA和抗LF的兔多抗滴度,表明家兔存活下来后自身已经建立起抗炭疽的体液免疫应答。在使用致死毒素家兔模型对5E11进行药效评价之后,我们考虑到芽孢攻毒更加接近人的自然感染,但在使用强毒株攻毒条件受限的情况下,尝试用炭疽的弱毒株对5E11做效力评价。我们使用多种剂量的荚膜缺失的炭疽疫苗株A16R对DBA/2J小鼠攻毒,通过Bliss法计算得到的LD50为7.8×103 CFU。而后我们通过ELISA实验测出了5E11在小鼠体内的药代动力学参数,其平均半衰期为7.5天。在药效学部分,我们根据已经建立的致死模型,使用100倍LD50的A16R芽孢攻击小鼠,之后根据给药时间和给药剂量这两个变量分多组进行抗体保护实验,结果攻毒后1天给药的各剂量组均能提供完全保护,攻毒后2至3天给药的各剂量组能提供40%至80%保护,且没有发现剂量依赖性。说明攻毒后给药时间影响治疗效果,越早越好,而不同的给药剂量差别不大。对于存活小鼠进行的抗炭疽毒素多抗滴度检测,验证了A16R菌株在感染小鼠过程中确实产生毒素,并可激起小鼠体液免疫应答。综上所述,经过致死毒素攻毒实验及对实验过程中家兔诸多方面的观测、分析和比较,我们建立了致死毒素家兔模型,并使用该模型设计实验从预防和治疗两个方面对5E11的效力进行评价,结果显示出5E11良好的保护效果。而后我们通过炭疽疫苗株A16R攻击DBA/2J小鼠模型继续评价5E11的治疗效力,结果仍然显示出5E11较好的保护效果。综合两种动物模型的评价结果,我们认为单克隆抗体5E11具有可用于炭疽芽孢感染导致的急性炭疽的紧急预防和治疗的潜力。