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背景木聚糖酶(Xylanase) [EC3.2.1.8]在木聚糖降解过程中作用非常重要,能够将木聚糖降解为木糖和低聚木糖。其在环境、食品、饲料、能源、造纸等行业均有广泛的应用。产木聚糖酶的微生物分布很广,不同来源以及不同种类的木聚糖酶具有不同的催化特性,使用各种手段来提高木聚糖酶的产量并降低其生产成本,是亟待解决的问题。目的构建木聚糖酶毕赤酵母基因工程菌,优化工程菌产酶条件,实现木聚糖酶的高效表达；分析重组酶的酶学性质,为木聚糖酶的工业应用提供理论依据。方法1.毕赤酵母工程菌构建将A.niger XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2和xynZF-3重组到真核表达载体pPIC9K 上,线性化后,分别电击转入毕赤酵母GS115和KM71中,G418初筛、摇瓶复筛出4株木聚糖酶高产菌株。2.工程菌发酵条件的优化对重组菌产酶的接种时间、诱导温度、发酵培养起始pH、甲醇诱导浓度、诱导时间等进行单因素优化,在此基础上进行正交和响应面综合试验。3.重组酶酶学性质的分析测定重组酶的最适作用温度、最适作用pH、热稳定性、pH稳定性以及金属离子和EDTA对酶的影响,通过薄层层析分析重组酶的水解产物,测定重组酶的动力学常数。结果1.成功构建4种木聚糖酶工程菌,分别命名为GS115/pPIC9K-2、 GS115/pPIC9K-3、KM71/pPIC9K-2、KM71/pPIC9K-3,并成功实现异源表达。2.得到4株菌的最优发酵条件,GS115/pPIC9K-2甲醇浓度1.0%,接种时间31h,诱导时间104 h,诱导温度30℃、发酵起始pH值40; KM71/pPIC9K-2:甲醇浓度2.0%,接种时间26h,诱导时间132 h,诱导温度30℃、发酵起始pH 6.2;GS115/pPIC9K-3:甲醇浓度2.0%,接种时间24 h,诱导时间108 h,诱导温度30℃、发酵起始pH6.3; KM71/pPIC9K-3:甲醇浓度1.75%,接种时间26 h,诱导时间132 h,诱导温度30℃、发酵起始pH 6.5。验证性实验结果比酶活力分别为36523.2 U-mg-1、 8654.28 U-mg-1、139.36 U-mg-1、143.29 U·mg-1。3.酶学性质分析结果如下：GS115/pPIC9K-2最适作用温度和pH分别是45℃和6.0; KM71/pPIC9K-2最适作用温度和pH分别是45℃和55; GS115/pPIC9K-3最适作用温度和pH是45℃和5.0; KM71/pPIC9K-3最适作用温度和pH是40℃和5.0；Ca2+、Fe2+和EDTA对重组酶有不同程度的促进作用,Fe3+、Mn2+、Cu2+对重组酶具有明显的抑制作用。这4种重组木聚糖酶在温度50℃以下,pH 5-7范围内酶活力相对稳定。4.薄层层析结果显示,重组酶XynZF-2水解桦木木聚糖的产物为：木二糖和五糖。5.4种酶的动力学常数为：Km分别为15mg·L-1、1.25 mg·L-1、3.56 mg·L-1、3.04 mg·L-1, Vmax分别为2500 mol·mL-1、2680μmol·mL-1·min-1、1368 μmol·mL-1·min-1、1589μmol·mL-1·min-1。结论黑曲霉XZ-3S菌株来源的2种木聚糖酶基因,在毕赤酵母GS115和KM71中成功实现异源表达。发酵条件优化后,毕赤酵母工程菌的产酶量远远高于原核细胞中的表达量,重组酶热稳定性和pH稳定性优于原核表达重组酶。