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[目的]Ki67在乳腺癌的分子分型中起着至关重要的作用,是乳腺癌患者是否接受细胞毒治疗及其预后判断的重要指标。然而,不同观察者之间乳腺癌Ki67免疫组化结果判读重复性差,缺乏统一规范的乳腺癌Ki67免疫组化结果判读方法,近年Ki67临界值不断波动,影响乳腺癌患者的个体化治疗。因此急需建立一种准确性高、重复性好、易操作的乳腺癌Ki67免疫组化结果判读方法。本实验通过对视觉评估及软件自动计数等现有乳腺癌Ki67免疫组化结果判读方法改进,建立三种判读方法,通过多中心研究分析其可重复性,从而确立一种重复性好的乳腺癌Ki67判读方法,为乳腺癌患者接受规范合理的个体化治疗提供科学依据。[方法]100例乳腺癌组织,在同一实验室进行Ki67抗体免疫组化染色,经数字扫描存储为数字切片,由16家医院的41名病理医师评估乳腺癌Ki67指数。乳腺癌Ki67指数评估方法如下:(1)选择乳腺癌Ki67免疫组化染色中Ki67阳性肿瘤细胞最为集中的区域(即热点区)。(2)在热点区放置三个200×2000μm的判读框。(3)分别使用热点区域设定面积人工计数、热点区域设定面积视觉评估和热点区域设定面积自动计数法评估判读框内Ki67阳性指数。整理数据结果。中位数±四分位数间距用于描述两种判读方法所得Ki67指数在不同病理医师间的离散程度。统计分析两种Ki67免疫组化判读法在不同病理医师间的一致性,一致性评价选用组内相关系数(intraclass correlation coefficient,ICC)和 Bland Altman散点图。使用Wilcoxon符号秩和检验方法分析热点区域设定面积人工计数和热点区域设定面积自动计数法所得的乳腺癌Ki67免疫组化结果判读值的差异。[结果]一、本实验100例乳腺癌Ki67免疫组化数字切片中,有热点区切片占比83%;其中,51例为热点区散在分布,32例为热点区集中分布。热点区分布于肿瘤组织浸润性边缘的为29例,热点区分布于肿瘤组织中的为54例;热点区的最大径11740μm,最小径50μm,13例热点区直径小于<100μm,17例热点区直径在100-200μm之间,53例热点区直径>200μm。二、1000×100μm的判读框覆盖肿瘤细胞数为50个左右;200x200μm的判读框覆盖肿瘤细胞数为200个左右;300x300μm的判读框覆盖肿瘤细胞数为500个左右。三、不同病理医师采用热点区域设定面积人工计数法所得的Ki67评估值的四分位数间距小于热点区域设定面积视觉评估,说明热点区域设定面积人工计数法的离散程度小于热点区域设定面积视觉评估。四、热点区域设定面积视觉评估的ICC值为0.802(95%置信区间为0.756,0.846)。热点区域设定面积人工计数的ICC值为0.942(95%置信区间为0.926,0.957)。热点区域设定面积人工计数和热点区域设定面积视觉评估重复性均在可接受的范围内,热点区域设定面积人工计数可重复性优于热点区域设定面积视觉评估可重复性。五、高年资医师(n=35)使用热点区域设定面积人工计数的ICC值为0.953(95%置信区间为0.940,0.965);使用热点区域设定面积视觉评估的ICC值为0.805(95%置信区间为0.760,0.849)。低年资医师(n=6)使用热点区域设定面积人工计数的ICC值为0.903(95%置信区间为0.873,0.928);使用热点区域设定面积视觉评估的ICC值为0.786(95%置信区间为0.730,0.837),表明高年资医师间乳腺癌Ki67免疫组化结果判读重复性优于低年资医师。六、热点区域设定面积人工计数法重复性显示:同质组的ICC值为0.965(95%置信区间0.939,0.985);热点集中组的ICC值为0.930(95%置信区间0.894,0.959);热点散在组的ICC值为0.833(95%置信区间0.776,0.886)。热点区域设定面积视觉评估法的重复性显示:同质组的ICC值为0.875(95%置信区间0.792,0.942);热点集中组的ICC值为0.704(95%置信区间0.601,0.810);热点散在组的ICC值为0.597(95%置信区间0.505,0.698)。热点区域设定面积人工计数和热点区域设定面积视觉评估判读方法在同质和热点集中组中重复性均优于热点散在组。七、地州医院病理医师间乳腺癌Ki67免疫组化结果判读重复性与省级医院病理医师间重复性相差很小。八、Bland-Altman散点图显示,相比热点区域设定面积视觉评估,两名病理医师用热点区域设定面积人工计数所得的Ki67判读值的差值(圆点)更靠近中间的实线,表明热点区域设定面积人工计数重复性优于热点区域设定面积视觉评估。九、Wilcoxon符号秩和检验分析结果显示,热点区域设定面积人工计数判读值大于热点区域设定面积自动计数,说明自动计数软件不够成熟,不能精准地识别肿瘤细胞。[结论]热点区域设定面积人工计数法判读重复性好、准确性高且易操作,可作为一种乳腺癌Ki67免疫组化结果的判读方法。