林麝肺源致病性大肠杆菌在BALB/c小鼠体内感染模型的建立和全基因组测序与分析

来源 :四川农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shilei881222
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林麝肺炎是林麝人工养殖中危害最严重的疾病之一,其致病力强、危害大、严重阻碍了人工养麝的发展。林麝肺源致病性大肠杆菌(Lung Pathogenic Escherichia coli,LPEC)是引起该病的重要致病菌之一。本文对实验室前期保存的1株林麝LPEC优势血清型O78菌株进行了以下研究:采用人工感染的方法构建林麝LPECO78 BALB/c小鼠感染模型;利用Illumina Miseq测序平台和生物信息学方法对林麝LPECO78进行全基因组测序和比较基因组学分析。试验结果如下:1林麝LPECO78在BALB/c小鼠体内感染模型的建立通过LD50试验,确定了 LPEC O78对小鼠的LD50为3.6×108 CFU/只。试验组小鼠于攻毒后3 h出现精神萎靡、嗜睡、食欲不振、反应迟钝、被毛耸立等临床症状,剖检见肺脏、肝脏肿大。而生理盐水对照组采食、精神状态以及活动情况均正常,剖检也未见异常。生化试验中各项指标均有一定的变化,其中,肝实质损害的两个重要指标:谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)均呈不同程度的升高。对病理组织切片观察发现试验组小鼠的肝、脾、肺、肾和肠道(十二指肠、空肠、回肠和结肠)也均有不同程度的病理损伤。2林麝LPECO78的全基因组测序及注释分析全基因组注释分析结果显示,完成测序的林麝LPECO78全基因组大小为5,376,541bp,测序深度为 105×,GC 含量为 50.58%,拥有 203 个 contigs、2 个 rRNA操纵子以及88个tRNA。此外,利用多种生物信息学软件和数据库对其他元件进行预测分析,毒力基因结果发现林麝LPEC078拥有尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E.coli,UPEC)(Ⅰ型菌毛、血红素吸收、铁运输、Ⅵ型分泌系统)、新生儿脑膜炎致病性大肠杆菌(Neonatal Meningitis-causing E.coli,NMEC)(K1 capsule、AslA、OmpA)以及禽致病性大肠杆菌(Avianpathogenic E.coli,APEC)(iss、traT、iroN、hly)所特有的毒力基因,表明该菌是一个嵌合型的致病菌。同时,还预测出30个可信的插入序列(Insertion Sequence,IS)元件和8个完整的前噬菌体。3林麝LPECO78的进化分析和比较基因组学分析系统发育树结果表明林麝LPECO78与人源尿道致病性大肠杆菌UMNO26(GenBank:NC011751)的亲缘关系最近、其次是肠黏附性大肠杆菌O42(GenBank:NC017626)和尿道致病性大肠杆菌IAI39(GenBank:NC011750),提示该菌株具有公共卫生学意义。利用OrthoMCL软件,首先将林麝LPEC O78与3株D群大肠杆菌UMNO26、O42、IAI39进行同源基因聚类分析,共获得6362个基因簇。其中,4株菌株核心基因簇有3579个,占总基因簇的56.26%。分析同时存在于2株菌中共有的基因簇和同时存在于3株菌中共有的基因簇时,前者统计发现LPEC O78与UMNO26共有的基因簇有165个,基因簇数量显著多于其他组合,后者统计发现LPEC O78、UMNO26和042所共有的基因簇有363个,基因簇数量也显著多于其他组合。以上聚类结果说明林麝LPEC 078和UMN026之间的进化关系很近,这一结果与系统发育树结果相一致。其次,将林麝LPEC O78与3株O78血清型大肠杆菌APECO78、ACN001和ACN002也进行同源基因聚类分析,共获得6208个基因簇。4株菌株的核心基因簇有3664个,占总基因簇的59.02%。分析同时存在于3株菌中的共有基因簇时,发现同为禽源B1群系的APEC O78、ACN001和ACN002所共有的基因簇有388个,基因簇数量显著多于其他菌株间的组合。该结果说明了 APEC O78、ACN001以及ACN002之间的进化关系非常近,而LPEC O78与这3株菌之间的进化关系较远。这一结果也与系统发育树相一致。利用COG、GO数据库对林麝LPEC O78的特有基因簇进行功能注释,发现相对较多的蛋白参与到氨基酸、无机离子以及糖类等的代谢,说明林麝LPEC078的代谢活动可能非常活跃。且DNA复制、重组和修复这一功能分类在LPEC O78中占据了极大比例,可能与该菌株的生存环境密切相关。该结果也验证了基因组比较大的菌株通常具有比较强的代谢能力,使之能够适应多变的生存环境。此外,对菌株的核心基因簇功能注释发现多数核心基因簇参与到细胞的代谢生长等过程,反应了核心基因的存在对细胞生存的必要性。
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