抗拟除虫菊酯类农药抗体的制备、鉴定及初步应用

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以间苯氧基苯甲酸(PBA)为半抗原,用活性酯法、混合酸酐法、6-氨基己酸法偶联鸡卵清蛋白(OVA)制备三种包被抗原,其中6-氨基己酸法合成的包被抗原效果最优。以实验室自制拟除虫菊酯类农药的广谱性抗体为材料,以现场快速检测这一类农药主要目的,建立并优化了大白菜中拟除虫菊酯类农药的半定量酶联免疫吸附测定法(ELISA)免疫检测方法。结果表明,检测无需将抗原抗体过夜提前预混,抗原抗体反应时间以45min较佳;大白菜基质对检测影响较小,无需净化步骤,对54个大白菜样品检出率的假阳性率和假阴性率分别为7.41%和1.86%,表明该方法可以作为大量大白菜样品快速初筛的方法。制备抗拟除虫菊酯类农药(Pyrethroids)的广谱性单克隆抗体(MonoclonalAntibody,mAb),并鉴定其免疫学特性;以间苯氧基苯甲酸(PBA)为半抗原,用活性酯法偶联牛血清蛋白(BSA)制得人工抗原PBA-BSA免疫Balb/c小鼠,五次免疫后选择效价最高、对PBA识别能力最强的小鼠取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG)1500作用下融合,经间接ELISA筛选及有限稀释法进行亚克隆,分离阳性细胞株,腹水诱导法大量制备单克隆抗体并用protein G亲和柱纯化,间接ELISA法测定抗体效价、亚型、亲和力常数及对拟除虫菊酯类农药的作用。UV结果显示,PBA-BSA成功偶联,获得1株稳定分泌抗拟除虫菊酯类农药单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11,其培养腹水抗体效价为1:6.5×106,其抗体亚类为IgG1,对PBA的亲和力常数为2.5×107L/mol,对PBA的抑制中浓度(IC50)为208.93ng/mL,最低检测限为21.23ng/ml,对高效氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯和氯氰菊酯的IC50分别为1.01、2.15、3.16、3.67μg/mL。表明该单克隆抗体作为一种广谱性抗体,可以同时检测几种拟除虫菊酯类农药,为该类农药的快速检测应用奠定了基础。
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