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随着对心血管疾病研究的不断深入,血管内皮功能与心血管疾病的关系备受关注。目前普遍认为,心血管疾病发生机制的起始及核心环节是血管内皮功能受损。研究显示,内皮细胞在受到刺激或凋亡时会释放微囊泡(microvesicels,MV),外周血循环内皮MV水平的升高可见于包括冠状动脉疾病在内的多种病理状态。心肌缺血/再灌注作为这类疾病的病理生理基础,可引起心肌的损伤及凋亡坏死。但有关缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)诱导的内皮细胞来源MV对心肌细胞的作用尚无报道,又至关重要。本实验拟通过H/R诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)产生 MV,研究其对培养H9c2心肌细胞的作用,探讨H/R诱导HUVECs释放的MV(H/R-induced endothelial microvesicles,H/R-EMV)对心肌凋亡相关蛋白表达的影响,为心肌缺血/再灌注损伤机制研究开辟新的方向。目的:研究H/R-EMV对H9c2心肌细胞的作用,探讨该作用与心肌caspase 3活性和Bcl-2/Bax蛋白表达的关系。方法:1.H/R诱导HUVECs损伤模型的建立用含10%FBS的DMEM培养基培养HUVECs 24 h后,采用不同的缺氧/复氧条件处理细胞,通过MTT法检测细胞存活率,选择适宜的缺氧/复氧时间,建立H/R诱导HUVECs损伤的模型。2.H/R-EMV的诱导、流式鉴定及定量检测接种到培养板的HUVECs达到融合后,弃去培养上清液,换用缺氧液,在缺氧装置中HUVECs缺氧培养12 h,继而复氧培养4 h。从细胞缺氧/复氧的培养上清液中收集EMV,采用流式细胞仪对其进行鉴定,通过标准微球对EMV进行计数,采用BCA法对EMV进行蛋白定量。3.H/R-EMV对H9c2细胞的凋亡作用及其相关蛋白表达用含10%FBS的DMEM培养基培养H9c2细胞24 h。实验细胞分为正常对照组(Control组)、10、30 及60 μg/mL H/R-EMV组,共4组。Control组加入无FBS的DMEM培养基;H/R-EMV 10、30及60组分别加入10、30及60 μg/mL的H/R-EMV,孵育6h。通过MTT法检测细胞存活率,比色法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性;采用Hoechst 33258染色从形态学观察H9c2细胞凋亡,通过流式FITC-Annexin V/PI染色检测H9c2细胞凋亡率,比色法检测H9c2细胞caspase 3活性;Western blot法检测H9c2细胞中BBcl-2/Bax的表达。结果:1.H/R诱导HUVECs损伤模型的建立在缺氧12 h复氧4 h处理后,HUVECs出现皱缩、变形,与Control比较,MTT检测细胞存活率显著降低(70.53%±2.61%vs 100%±0%,P<0.05),且降低程度适中,实验结果稳定,适宜采用该模型诱导HUVECs损伤。2.H/R-EMV的诱导、流式鉴定及定量检测通过缺氧12 h复氧4 h诱导HUVECs释放MV,流式检测证实诱导得到粒径<1 μm且CD144+的微粒,即EMV,计数结果为24014±322/μL。EMV蛋白浓度为 0.37±0.07 μg/μL。3.H/R-EMV对H9c2细胞的凋亡作用及其相关蛋白表达与Control比,H/R-EMV 30和H/R-EMV 60组细胞存活率明显降低(90.03%±6.06%,78.74%±7.36%vs 100%±0%,P<0.05 或 P<0.001),H/R-EMV 60组细胞培养液中LDH活性显著增高(142.1±9.99 vs 108.9±7.10,P<0.001),而H/R-EMV 10 组 LDH 活性有所降低(92.32±18.69 vs 108.9±7.10,P<0.01);从Hoechst 33258染色观察到随H/R-EMV浓度增加,细胞核凝聚,可见细小不规则颗粒状,细胞碎片增多;与Control比,流式FITC-Annexin V/PI双染H/R-EMV 60 组细胞凋亡率明显增高(17.71%+2.81%vs 7.57%±0.92%,P<0.01),H/R-EMV 60 组 caspase 3 活性显著增加(292.50±28.03 vs 138.80±26.10,P<0.01)。Western blot结果显示,与Control比,随H/R-EMV浓度增加,各组Bcl-2蛋白表达减少,Bax蛋白表达逐渐增多,两者比值下降,其中H/R-EMV 30和H/R-EMV 60组Bcl-2/Bax显著下降。结论:1.本实验成功建立了缺氧12 h复氧4 h诱导HUVECs损伤的模型。2.采用缺氧12 h复氧4 h的方法诱导HUVECs产生MV,流式检测证实诱导得到粒径<1 μm且CD144+的EMV,其蛋白浓度为0.37±0.07 μg/μL。3.H/R-EMV对H9c2细胞存活产生影响,降低H9c2细胞存活率,增加LDH漏出,其中60 μg/mL H/R-EMV作用最显著;H/R-EMV促进H9c2细胞凋亡,增高H9c2细胞caspase 3活性,减少Bcl-2/Bax蛋白的表达,提示H/R-EMV可能通过提高caspase 3活性及下调Bcl-2/Bax的表达产生促凋亡作用。