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研究背景支气管哮喘(哮喘)是一种常见的变应性疾病,患病率和病死率逐年上升,成为危害人类健康的重大疾病。哮喘病因不清,发病的危险因素与患者个体变应性体质和环境因素有关,呈家族聚集性,具有明显的遗传倾向,在遗传因素中,又有多个基因在起作用,这些不同基因构成的遗传背景中,可能有易感性主基因起着重要作用。目前越来越多的国内外研究者针对哮喘的遗传病因学进行大量的研究,希望能够探查出哮喘人群的易感基因,根据易感基因的探索发现,人类能够更好地了解哮喘的发生,从而为寻找哮喘有效的治疗方案提供有力证据。解整合素-金属蛋白酶33 (a disintegrin and metalloproteinase 33, ADAM33)是近年来发现的一个新的哮喘易感基因,是ADAM家族成员。研究显示,ADAM33基因核苷酸序列的改变促进哮喘的发生,对哮喘的发病具有重要的影响,而另外一些研究却得出与上述相矛盾的不同结果,认为ADAM33与哮喘的发生并无密切联系。为探讨山东地区汉族人群ADAM33基因多态性与哮喘之间的关联性,本研究以正常健康人和哮喘患者为研究对象,检测山东地区汉族人群哮喘患者ADAM33基因变异,应用现代分子生物学方法,对目前已知的可能涉及哮喘发病的ADAM33基因F+l、S2、T2和V4位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)进行检测,了解ADAM33基因F+1、S2、T2和V4位点SNPs与山东地区汉族哮喘患者的相关性,在分子水平探索遗传因素在哮喘发病中的作用。希望通过对该基因与疾病相关性的研究,增进我们对该基因与哮喘的进一步认识,为哮喘疾病提供早期筛查方法,从而及早对哮喘患者进行干预,减少哮喘发病并指导相应的基因治疗。ADAM33编码一种基质金属蛋白酶,mRNA的表达具有一定组织特异性,在T细胞、支气管上皮细胞及其它免疫细胞中表达较少,间质细胞起源的肺平滑肌细胞(airway smooth muscle, ASM)和成纤维细胞是其主要表达部位,根据它在间质细胞的选择性表达,其活性的改变引起ASM细胞和成纤维细胞功能的异常,近年来研究显示, ADAM33在气道高反应、气道重塑中起着非常重要的作用,ADAM33发现时间较短,对其与哮喘之间的关系研究较少,在哮喘气道重塑中的表达和功能变化情况还不清楚,本实验应用慢性哮喘小鼠模型,观察肺组织中ADAM33的表达,早期吸入布地奈德进行干预,同时与地塞米松全身用药相比较,观察其对ADAM33基因表达的影响及能否预防或减轻气道重塑的发生,探讨慢性哮喘ADAM33与气道重塑的相关性,阐明其作用的机制,评价其与气道重塑的关系以及早期吸入布地奈德干预的价值。本课题研究内容共分为以下两部分。第一部分ADAM33基因位点单核苷酸多态性与山东地区支气管哮喘患者的相关性研究研究目的检测ADAM33基因位点多态性在哮喘患者中的分布频率,探讨ADAM33的SNPs与山东地区汉族哮喘患者的相关性。寻找哮喘发病的易感基因,为哮喘高危人群的筛选、早期预防和临床治疗提供理论依据。研究方法采用等位基因特异性聚合酶链反应(Allele-Specific PCR, AS-PCR)技术及DNA测序的方法,对126例哮喘患者及121例健康人进行ADAM33基因F+1、S2、T2和V4位点SNPs分析,数据均采用SPSS13.0统计软件计算,两样本均数的比较采用t检验,采用χ2检验验证是否符合遗传Hardy-Weinberg平衡定律以及组间等位基因型或等位基因的比较,SNPs与哮喘的相对危险度采用单变量logistic回归方法分析；采用非参数检验哮喘患者S2位点基因型与不同病情严重程度的关联,采用方差分析比较肺功能FEV1实/预、FEV1/FVC和FVC实/预与哮喘的关联。研究结果(1) ADAM33基因F+1、S2、T2和V4位点PCR扩增产物显示分别为3种基因型,经χ2检验,在哮喘组和健康对照组中差异均无统计学意义(哮喘组χ2值分别为0.139、3.653、0.561、3.456,健康对照组χ2值分别为0.572、0.289、2.423、2.470,均P>0.05),哮喘组和健康对照组均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,说明两组研究样本的群体代表性好。(2)ADAM33基因哮喘组与健康对照组F+1、T2和V4位点基因型差异无统计学意义(χ2值分别为1.638、1.050、0.369,均P>0.05)；哮喘组与健康对照组S2位点基因型及等位基因频率差异均有统计学意义(χ2值分别为6.929和5.122,均P<0.05),基因G能明显增加哮喘的相对危险性(OR=1.59；95%CI为1.06-2.38)。(3)哮喘患者根据病情严重程度分为轻、中、重三组,经非参数检验分析,x2值为0.335,P=0.855>0.05,S2位点多态性与哮喘病情严重度无统计学相关。肺功能指标FEV1实/预、FEV1/FVC和FVC实/预与S2位点基因型构成的关联,经方差分析,P值分别为0.255、0.143、0.404,均>0.05,S2位点多态性与肺功能指标无显著相关性。研究结论(1) ADAM33基因F+1、S2、T2和V4位点在山东地区汉族人群中存在多态性。(2) ADAM33基因S2位点基因多态性与山东地区汉族哮喘患者明显相关。(3)ADAM33基因S2位点基因多态性与山东地区汉族哮喘患者病情严重程度和肺功能没有显著关联。第二部分ADAM33在慢性哮喘小鼠中的表达与布地奈德干预效应的研究研究目的探讨ADAM33在慢性哮喘小鼠气道重塑中的作用及布地奈德(BUD)干预对哮喘小鼠肺内ADAM33表达致气道重塑的影响。研究方法健康成年雌性BALB/c健康成年雌性γ小鼠24只,随机分为4组,A组(慢性哮喘组)、B组(生理盐水对照组)、C组(地塞米松组)及D组(BUD治疗组),每组6只。A组：于第1、14天小鼠腹腔注射卵蛋白致敏液进行致敏；从第21天开始为激发阶段,雾化吸入2.5%的OVA溶液,每次30min,每周3次,连续20次。B组：小鼠在致敏阶段腹腔注射生理盐水代替,激发阶段雾化吸入生理盐水。C组：每次激发前腹腔注射地塞米松(1mg/kg)。D组：每次激发前1小时雾化吸入BUD溶液(0.5mg/ml的普米克令舒l0ml),每次30min,每周3次,持续到最后一次OVA雾化,连续共20次。在末次激发24h后,取血ELISA法测定血清白介素-4、5(IL-4、5)、Y-干扰素(IFN-γ)和转化生长因子-β1 (TGF-β1),对支气管肺泡灌洗液(BALF)行细胞计数并分类,左肺组织行HE染色、Masson’s Trichrome染色,测定支气管基底膜周径(Pbm)、总管壁面积(wAt)及平滑肌面积(wAm),并用Pbm标准化,采用计算机图像分析系统进行分析以评价气道重塑的情况,采用等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)技术测定右肺组织ADAM33 mRNA表达水平。研究结果A组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞数,血中TGF-β1、IL-4、IL-5的浓度均较B组明显增高(P<0.05),而C、D组较A组均明显下降(P<0.05),较B组仍有明显增高(P<0.05)；A组IFN-γ的浓度明显低于B组(P<0.05),而C、D组较A组均明显增高(P<0.05),较B组仍有明显降低(P<0.05);C组和D组之间无显著差异(P>0.05)。病理结果显示A组Masson’s染色WAt/Pbm及WAm/Pbm较B组增高,差异均有统计学意义(P<0.05),C组与D组WAt/Pbm及WAm/Pbm较A组下降,差异有统计学意义(P<0.05),较B组仍有明显增高(P<0.05)。C组与D组之间无显著差异(P>0.05)。四组小鼠肺组织中ADAM33基因mRNA的表达,A组ADAM33基因mRNA的表达量(0.572±0.127)较B组(0.193±0.091)明显增高(P<0.05),C组(0.341±0.065)与D组(0.308±0.115)较A组明显下降(P<0.05),较B组仍有明显增高(P<0.05),C、D两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。肺组织中ADAM33基因mRNA表达与血清中TGF-β1呈显著正相关性(r为0.919,P<0.05),与IL-4、INF-γ及IL-5无显著相关性(r为0.589、-0.116及0.443,均P>0.05)。研究结论小剂量OVA致敏和激发可成功复制慢性哮喘小鼠模型,显示黏膜杯状细胞分泌的粘液增加、上皮下纤维化、气道平滑肌层明显增厚等气道重塑的病理结果,表现以Th2细胞反应为主的慢性气道炎症,ADAM33基因mRNA的表达量增高。经BUD干预气道重塑减轻,可能与通过调节ADAM33表达有关。