干扰素γ(interferon gamma, IFNγ)在宿主抵抗肝炎病毒的过程中发挥着重要的作用。IFNγ能通过非细胞溶解方式抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染肝细胞中HBV的复制中间体并降解HBV在复制过程中产生的前基因组RNA,从而显著降低了细胞中的病毒水平。IFNγ的这些作用已经在细胞水平和HBV转基因或HBV感染的动物模型中得到证实。然而在临床上如果给HBV患者全身应用重组人IFNγ,为了保证IFNγ在肝细胞中达到有效治疗浓度,就需要较大剂量的应用IFNγ以获得相应的血药浓度,这样就会导致因IFNγ带来的严重全身不良反应而停止治疗的后果。因此,建立一种肝细胞特异性的、可调控的IFNγ表达的基因治疗方法成为最佳解决方案。我国是乙型肝炎的高发区,我国一般人群的HBV表面抗原(hepatitis B virus surface antigen, HBsAg)携带率高达10%,约占全世界HBsAg携带者人数的1/3以上,其中75-90%的原发性肝癌与此有关。由于整合在人体基因组的HBV基因片段中,以S基因、X基因和增强子I最多,其中S基因启动子具有很强的启动转录功能,HBsAg过表达是肝细胞变性坏死的原因之一。根据这一特性,我们构建了具有内源性生理调控功能的人IFNγ表达载体,能够介导目的基因在表达HBsAg肝细胞中的特异性表达。通过以HBV持续转录的S基因为靶基因,利用生理调控性的基因治疗载体,携带效应基因IFNγ,能很好的提高局部感染肝细胞周围的IFNγ浓度,细胞特异性地非细胞溶解性清除HBV。由于载体的细胞特异性调控作用,未感染病毒的肝细胞周围的IFNγ浓度不会增高,并且IFNγ的表达也不会处于无调控的持续表达状态,因此不会高水平激活体内免疫系统,诱发肝细胞大量坏死,造成暴发性肝炎的发生。第一部分在表达HBsAg肝细胞中特异性表达的人IFNγ真核表达载体(pcDNA3.1-SCⅡ)的构建目的：课题组成员在既往工作中成功构建了含有效生物学功能的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)核糖体插入位点(internal ribosome entry site, IRES)的双顺反子真核表达载体。为了建立一种用于HBV基因治疗的,以非病毒载体介导的肝细胞特异性IFNγ表达的基因递送系统,我们利用上述HCV IRES,以pcDNA3.1载体为基础,构建以HBVS基因为靶基因,IFNγ基因为效应基因的双顺反子真核表达载体。方法：根据既往研究中的方法,PCR扩增出具有有效生物学活性的HCV IRES。然后,我们以pcDNA3.1载体为基础,构建双顺反子表达载体：在IRES位点的上游克隆HBsAg基因的部分反向序列和HCV全长核心蛋白(core protein)基因,在IRES位点下游克隆人IFNγ基因。这样,在pcDNA3.1载体的巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)启动子下依次驱动部分HBV反义S基因(antisense S gene)、HCV核心蛋白基因,下游是HCV IRES部分有效序列和IFNγ效应基因,即HBV-anti S/HCV core-IRES-IFNγ载体系统,简称为pcDNA3.1-SCⅡ载体系统。当细胞内HBV表达HBsAg时,此载体中HBV S基因反义序列转录的mRNA,可以与HBV S基因的mRNA结合,也就在HCV核心蛋白基因起始密码子AUG前形成mRNA二聚体,抑制了HCV核心蛋白的表达,从而解除了HCV核心蛋白对HCV IRES的制约,IRES启动下游IFNγ基因表达增强。这样,受感染的肝细胞因表达HBsAg而自我同时表达IFNγ;而在正常无HBV S基因存在的细胞中,则不会介导IFNγ表达。结果：通过PCR或酶切含目的片段质粒的方法获得的pcDNA3.1-SCⅡ载体中的四个基因片段：HBV anti S, HCV core, HCV IRES和人IFNγ基因分别和T载体连接后,经PCR、酶切及测序鉴定后证实,获得的四个基因片段均与Genbank上登录的序列有97%以上的同源性。通过亚克隆最终构建的pcDNA3.1-SCⅡ载体,经双酶切和测序鉴定表明,四个基因片段完全正确的插入了pcDNA3.1载体。结论：经酶切和测序初步鉴定,成功构建了pcDNA3.1-SCⅡ载体。第二部分体外实验分析pcDNA3.1-SCⅡ载体中效应基因人IFN-γ的细胞特异性表达目的：观察构建的pcDNA3.1-SCⅡ载体能否有效介导表达HBsAg的肝细胞特异性的人IFN-γ表达。方法：(1)用双酶切pEGFP-N1质粒获得的编码绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的GFP基因替换pcDNA3.1-SCⅡ中的人IFN-γ基因,构建出质粒pcDNA3.1-SCIGFP。用脂质体2000体外转染试剂将质粒pcDNA3.1-SCIGFP分别瞬时转染HepG2和HepG2.2.15细胞。转染48h后,荧光显微镜下观察GFP的表达。同时构建了pcDNA3.1-GFP质粒,分别瞬时转染两种细胞后,荧光显微镜下观察GFP表达,判断pcDNA3.1介导的重组载体在两种细胞中转染效率。(2)用同样方法将不同质量(4μg、8μg和16μg)的pcDNA3.1-SCⅡ载体分别转染HepG2和HepG2.2.15细胞。在转染后24h、48h、72h和96h的4个不同时间点,ELISA检测两种细胞培养上清中IFN-γ的含量。转染72h后,采用逆转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)法检测两种细胞中人IFN-γ在mRNA水平的表达。同时在转染后72h, Western blot检测两种细胞内IFN-γ蛋白的表达。(3)转染72h后,用RT-PCR法检测转染了8μg阴性对照质粒pcDNA3.1-SCIGFP及8μgpcDNA3.1-SCⅡ质粒的HepG2.2.15细胞内HBV S基因mRNA水平,以未转染质粒的HepG2.2.15细胞和转染了相同质量空白pcDNA3.1载体的HepG2.2.15细胞做对照,观察构建的pcDNA3.1介导的载体系统(pcDNA3.1-SCIGFP和pcDNA3.1-SCⅡ)对靶基因HBV S基因在mRNA水平的抑制作用。结果：(1)在相同的转染效率下,转染pcDNA3.1-SCIGFP后可导致GFP在HepG2.2.15细胞中的高表达,而在HepG2细胞中几乎没有表达。(2)转染pcDNA3.1-SCⅡ72h后, Western blot结果显示在不同的转染剂量下,IFN-γ在HepG2.2.15细胞内均呈阳性表达,而在HepG2细胞内均未检测到有效表达；RT-PCR结果显示,IFN-γ在mRNA水平的表达也得到一致的结果,并且其mRNA表达量随pcDNA3.1-SCⅡ转染剂量的增加而增加。ELISA检测两种细胞上清中IFN-γ的表达得到的结果表明,在不同剂量和不同时间点下,IFN-γ在HepG2.2.15细胞上清中有效表达,而在HepG2细胞上清中表达水平很低。IFN-γ在HepG2.2.15细胞上清中的表达也具有剂量效应,同时IFN-γ的表达量在转染后48h达到最高,在转染后96h仍未见明显下降。(3)RT-PCR检测HepG2.2.15细胞内HBV S基因结果显示,pcDNA3.1介导的载体系统(pcDNA3.1-SCIGFP和pcDNA3.1-SCⅡ)能够有效抑制编码HBsAg的S基因mRNA表达水平。结论：体外实验表明,pcDNA3.1-SCⅡ载体能够使外源基因有效的在表达HBsAg的肝细胞中特异性表达,并能有效抑制靶基因即编码HBsAg的S基因mRNA表达水平。第三部分pcDNA3.1-SCⅡ载体体外抑制乙肝病毒复制与表达的研究目的：以HepG2.2.15细胞为靶细胞,观察不同质量pcDNA3.1-SCⅡ转染细胞后,在不同时间pcDNA3.1-SCⅡ对细胞HBV基因复制和表达的作用,并观察pcDNA3.1-SCⅡ对细胞凋亡的影响。方法：将不同质量(4μg、8μg和16μg)的pcDNA3.1-SCⅡ载体用脂质体瞬时转染HepG2.2.15细胞,在转染后24h、48h、72h和96h的4个不同时间点,用ELISA法检测细胞分泌上清中HBsAg和HBVe抗原(hepatitis B virus e antigen, HBeAg)含量；用荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR)方法检测细胞分泌上清中HBV DNA含量；以上实验,均用未转染的HepG2.2.15细胞作空白对照、转染了阴性对照质粒(pcDNA3.1-SCIGFP)的HepG2.2.15细胞作为阴性对照及用10μmol/l拉米夫定处理的HepG2.2.15细胞作阳性对照,观察pcDNA3.1-SCⅡ对细胞上清中HBV复制与表达的影响,并观察pcDNA3.1-SCⅡ作用的剂量-效应关系。在转染48h后,用Southern blot法检测细胞内HBV DNA复制中间体的含量；观察pcDNA3.1-SCⅡ对细胞内HBV复制的影响。在转染96h后,用Annexin V-FITC/PI法和流式细胞仪检测细胞凋亡,观察pcDNA3.1-SCⅡ对细胞凋亡的影响。用拉米夫定处理的HepG2.2.15细胞组作阳性对照,未转染的HepG2.2.15细胞作阴性对照。结果：在转染后4天里,不同质量的pcDNA3.1-SCⅡ与未转染细胞对照组相比均能显著降低细胞培养上清中HBsAg、HBeAg和HBV DNA的含量,且随着转染质量的增加,其抑制作用也随之增强(P<0.05)；而转染了阴性对照质粒对照组与未转染细胞对照组相比无显著性差异(P>0.05)。拉米夫定对细胞上清中HBVDNA抑制作用较强,但其抑制作用在第四天显著下降,而pcDNA3.1-SCⅡ在第四天仍表现出较强的抑制HBV DNA作用；拉米夫定对细胞上清中HBsAg和HBeAg抑制作用较弱,其对HBeAg抑制作用介于4μg和8μg pcDNA3.1-SCⅡ对HBeAg的抑制作用之间、其对HBsAg抑制作用更弱,低于4μg pcDNA3.1-SCⅡ对HBsAg的抑制作用。Southern blot法检测也表明pcDNA3.1-SCⅡ能够有效抑制HepG2-2.15细胞中HBV复制中间体含量,并且这种抑制作用也存在剂量-效应关系。我们观察到pcDNA3.1-SCⅡ对细胞上清中HBsAg.HBeAg和HBVDNA的抑制作用在转染后48h达到最强,并且pcDNA3.1-SCⅡ对HBsAg的抑制作用比其对HBeAg和HBV DNA的抑制作用强。在细胞凋亡实验中,与阴性对照组相比,拉米夫定阳性对照组能够明显增高细胞凋亡率(P<0.05),而pcDNA3.1-SCⅡ最高转染剂量(16μg)组总细胞凋亡率与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论：pcDNA3.1-SCⅡ能够有效抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制与表达,并不会显著诱导细胞凋亡的发生。