论文部分内容阅读
单纯疱疹病毒（HSV）属于疱疹病毒科中的α疱疹病毒亚科，是人类多种疾病的病原体。在HSV的复制过程中，核衣壳的组装是在细胞核内完成的。但对于核衣壳如何获得被膜和囊膜，目前尚有争论。一种意见认为，核衣壳在细胞核内获得被膜，并通过出芽在内层核膜处获得其囊膜后，进入核周间隙，进一步经与核周间隙相连接的内质网，以囊泡转运的方式经高尔基体到达细胞膜，囊泡膜与细胞膜融合，病毒颗粒释放到细胞外。另一种意见则认为，核衣亮在内层核膜处获得的囊膜是临时性的囊膜，这层囊膜与内质网膜融合后，脱囊膜的核衣壳至胞浆中。裸露的核衣壳在胞浆中的膜性区室——很可能是分泌面高尔基体网络（TGN）——以出芽的方式获得其囊膜，这个过程称为重包裹。最近的多项研究支持第二种观点。如果HSV确实是在胞浆中的膜性区室以出芽的方式获得其囊膜，那么，HSV的囊膜糖蛋白及某些被膜蛋白，必须在该膜性区室的膜上聚集，以使HSV在获得囊膜的脂质双层的同时，获得被膜蛋白及囊膜糖蛋白。已知多种α疱疹病毒糖蛋白E在细胞内定位于TGN，其定位的机制很可能是通过糖蛋白E胞浆区酸性氨基酸簇与磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白1（Phosphofurin acidic cluster sorting protein 1，PACS-1）的相互作用。本研究的目的即在于阐明除糖蛋白E外，还有哪些HSV的蛋白质定位于TGN，它们的定位机制是什么，PACS-1在这些蛋白质定位于TGN中有何作用，以及进一步阐明PACS-1在疱疹病毒发生中的作用。 首先我们根据文献报道的与PACS-1结合的酸性氨基酸簇的特点，采用序列分析的方法，以已完成全基因组测序的HSV-1 17株作为分析对象，从其蛋白组中筛选可能的PACS-1结合蛋白。结果表明，SWISS-PROT蛋白数据库中的HSV-1 17株所有71种蛋白质中可能与PACS-1结合的蛋白质共有33种，包括一些囊膜蛋白和被膜蛋白。 为了通过实验来验证筛选出来的33种蛋白质中，哪些可以与PACS-1结合；除HSV-1糖蛋白E外，哪些可以定位于TGN，我们在33种蛋白质中，选择HSV-1的糖蛋白B作为研究对象，探讨其在细胞中的定位，及其与PACS-1的作用。首先通过RT-PCR，从感染HSV的BHK-21细胞的总RNA中扩增出了HSV-1 SM44株糖蛋白B的胞浆区，将其克隆入pUC18 第M丫l＼上学博上沦文 摘要 进行测序。序列分析的结果表明，HSVI糖蛋白B胞浆区氨基酸序列在各 病毒株间高llfa保十，胞浆区含有1个核定位信号、2个以酪鼠酸为基础的基 序、l个含何CKll磷酸化位点的酸性氨基酸簇。其次，通过RTPCR，从 SD人鼠的脑组纤总 RNA中书增出J－队CS刁的功能区，将其克隆入pUC18 进行测序，结果表明其核符酸序列与文献报道的序列完全相同。然后利用 GST表达系统，在人肠杆菌 BLZI株中表达了 GST和 HSV糖蛋白胞浆【 的融合蛋臼一GSTMSVlg8Cd及GST和 PACS＊功能区的融合蛋白 GST／PACS．lfdu首先采用上交实验设汁优化厂蛋白表达的条件，然后在优 化的表达条件厂，人规模的制备厂 GST／HSVlgBCd和 GST／PACS刁。 GST川 1：ff以包涵体的形K存在，包渊体经溶解Xllffi拆叠门，蛋 白质浓度为 0．165mg／ml，t＄层扫描结果显不，融和蛋向的纯度为 32．188％。 制苗的 ＊Sw”叭＊S．1闹 经纯化和凝！血酶切割后，蛋I”I质浓度为 02刀37mg／ml，薄层扫描结果显示，凝血酶酶切产牛的 PACS＊ 蛋 I勺的纯 l尘为 475889／O；；以 GST／HSVlgBCd为抗你，劝1备］”鼠抗 GST／HSVlgBCd 血消，效价 31：400。以 PACS．lfd为抗原，制备厂兔抗 PACS．lfd血清， 效价3！：320（）；；贝疫荧光刊 Western blot的结汉表叨，两种免疫血清只有 较产的特仟性，汁能够识别人然和变性构象的HSVI炉和队C｝1。以卜 述内种见疫血淌作为抗体，泅过W标i己免疫荧光，将 HSV！gB和 PACS叫 穴I叶定位十感染厂HSVI SM44株的BHK－ZI细胞的TGN川兔抗PACS－lfd 血柞可以从感染细胞中共见疫沉淀HSVlgB和P八C丁！。＊ST俘获法显不 HSVlgBCd和 PACS1fd可以在体外结介，门这种结合依赖于CKI！催化的 HSVlgBcd的酸性笼基酸簇中的酪蛋H激酶11（CKll）磷酸化位点的磷酸 化。 以卜纪果表明，HSV屯B在感染 HSV！的细胞中定位于 TGN，这种定 位足巾十其胞浆区酸性氨基酸簇‘j PACS－l的结合。这捉示，HSV在其发 生过程中，胞浆中的核衣壳在TGN处通过出芽的方式获得其囊膜。PACSJ 通过将某些囊膜糖蛋白（可能还有一些被膜蛋白）定位于TGN 而可能在 HSV的发中过程中起着重要作用。我们的研究结果不仅有利于深入了解 HSV的发牛机制和 HSV与细胞的相互作用，而旦为设计针对病毒蛋白与 PACS－l结合的特?