【摘 要】
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目的利用Cre-Loxp系统构建在软骨中特异性敲除X-盒结合蛋白1（X-box binding protein 1,XBP1）基因的条件敲除小鼠,探究XBP1基因在小鼠软骨生长发育过程中的作用。方法将Ⅱ型胶原启动子启动Cre重组酶表达的Col2-Cre工具鼠与XBP1基因双侧标记Loxp位点的XBP1flox/flox小鼠进行杂交,利用Cre-Loxp系统,构建软骨中特异性敲除XBP1的条件性敲除
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目的利用Cre-Loxp系统构建在软骨中特异性敲除X-盒结合蛋白1（X-box binding protein 1,XBP1）基因的条件敲除小鼠,探究XBP1基因在小鼠软骨生长发育过程中的作用。方法将Ⅱ型胶原启动子启动Cre重组酶表达的Col2-Cre工具鼠与XBP1基因双侧标记Loxp位点的XBP1flox/flox小鼠进行杂交,利用Cre-Loxp系统,构建软骨中特异性敲除XBP1的条件性敲除小鼠（XBP1conditional knockout mice,XBP1 CKO）;收集不同周龄XBP1flox/flox对照小鼠与XBP1 CKO小鼠的体重、体长,监测XBP1基因缺陷对小鼠生长发育表型的影响;收集小鼠腿骨组织样本,进行石蜡切片,将切片进行苏木精-伊红（HE）染色和改良番红固绿染色,观察分析XBP1基因缺陷对小鼠股骨、胫骨的骨化中心、生长板总长、生长板增殖区以及肥大区的影响,免疫组化染色分析XBP1基因缺陷对小鼠生长板增殖、合成、肥大等标志性指标的影响;综合利用免疫印迹（Western blot）、实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）检测XBP1 CKO小鼠原代软骨细胞中增殖、肥大、合成代谢、分解代谢指标的变化;进一步利用剪接型X盒结合蛋白1转录因子（X—box binding protein 1spliced,XBP1s）过表达腺病毒（Ad-XBP1s）检测软骨细胞C28/I2中过表达XBP1s后,对软骨细胞增殖、肥大、合成代谢相关指标的影响;利用双荧光素酶报告基因实验,检测转录因子XBP1s对IHH,PTHr P,PTH1R基因表达调控作用,利用染色质免疫沉淀实验（Ch IP Assay）验证转录因子XBP1s与IHH,PTH1R的结合。结果成功构建了XBP1 CKO小鼠;相比于XBP1flox/flox对照小鼠,软骨中缺陷XBP1基因后,小鼠表现为体重减轻,体长变短的表型;XBP1CKO小鼠股骨、胫骨的次级骨化中心发生延迟矿化,生长板总长、生长板增殖区以及肥大区长度变短,增殖、合成、肥大等标志性指标表达降低,小鼠生长发育迟缓;人软骨细胞C28/I2中过表达XBP1s促进细胞增殖、合成、肥大分化指标的表达;WB结果显示XBP1 CKO小鼠原代细胞中IHH、PTH1R表达下调;q PCR结果显示过表达XBP1s,IHH、PTH1R表达上调;双荧光素酶报告基因和Ch IP实验结果显示,XBP1s可以分别结合IHH,PTH1R基因的启动子区进而上调其表达。结论XBP1基因缺陷后,损伤了PTHr P-IHH反馈环,导致XBP1 CKO小鼠发育迟缓。
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