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多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)表达系统具有强诱导型启动子、基因工程操作简单、易于在低廉的培养基中实现高密度发酵、表达产物更接近于天然状态等特点,是表达外源蛋白、特别是具有医药用途的真核蛋白的理想系统。
人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)是引起宫颈癌病变的一类小分子DNA病毒,由基因组DNA和外壳蛋白组成,其中异源表达的主要衣壳蛋白L1(～55kDa)能自我装配成病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs),VLPs有着与天然病毒颗粒十分相似的空间结构和衣壳蛋白,但不含病毒DNA,动物模型和人体临床试验结果均表明VLPs通过诱导产生高滴度抗体阻止病毒的感染,从而为生物体提供安全保护。所以,VLPs疫苗被认为是有前途的宫颈癌预防性疫苗。
本实验为了实现HPV16亚型衣壳蛋白L1蛋白在多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)中的高效表达,根据HPV16L1蛋白的氨基酸序列及多形汉逊酵母的密码子偏爱性,对L1蛋白编码序列进行优化设计,通过PCR搭桥的方法分两段合成了完整的L1蛋白的编码序列,命名为HPV16L1。将PCR扩增到的HPV16L1基因连接到多形汉逊酵母表达载体pMOXZα-A上,获得重组质粒pMOXZ-HPV16,其中HPV16L1的表达受甲醇诱导型启动子MOXp和终止子AOXTT的调控。通过PCR方法从重组质粒pMOXZ-HPV16克隆到表达框MOXp-HPV16L1-AOXTT,将其插入到酵母菌质粒载体YEp352,获得以URA3为筛选标记的重组质粒pYMOXU-HPV16。用SacⅡ酶切质粒pYMOXU-HPV16使其线性化,电转化多形汉逊酵母菌株H-ura3,依据营养缺陷互补筛选重组菌株。通过PCR扩增及HPV16L1蛋白表达量分析获得稳定高表达L1蛋白的重组汉逊酵母菌株HP-U-16L。摇瓶发酵条件的初步优化表明,以YPM(pH7.0)为基础培养基进行诱导培养,控制接种量使初始培养液OD600为1.0,每隔12h补加甲醇至终浓度为1％(v/v),37℃,200rpm条件下诱导培养72h后,HPV16L1蛋白的最高表达量为78.6mg/L。本研究为多形汉逊酵母源HPV16L1疫苗的研制奠定了重要基础。