成功的器官移植是治疗终末期器官功能衰竭的终极手段，但对供体的需求远远大于现有的供体数量，特别是在亚洲国家，由于捐献制度和理念的不同，中国、日本及其他国家的器官移植因为供体数量而受到限制。许多患者在等待器官的过程中失去生命。因此急需发现新的组织工程学方法或者再生医学策略来支持发展生物人工肝、细胞移植以至于器官移植来临时替代器官的功能。而将细胞移植与生物工程结合起来可能能解决这一难题。本研究将着重探讨生物工程技术在肝脏前体细胞移植和胰岛细胞移植中的应用研究。肝细胞移植是治疗肝脏各种疾病的非常具有吸引力的治疗手段。但距离临床应用治疗肝脏疾病还有一定的距离。肝细胞移植的临床应用因为难以获取好的供体以分离细胞而受到限制。近来的文章聚焦于可以分化为肝脏细胞的干细胞，以及肝脏的重新再细胞化策略来降低移植的细胞数量。暂时采取目前的免疫耐受方案可以克服宿主对异体移植细胞的免疫反应。近来已有研究发现对产后细胞的重新编程可以诱导多能干细胞，潜在的为病人提供了针对于患者的自体移植细胞来源。发现合适的干细胞来源可减少可移植细胞的数量。基于成年干细胞治疗严重慢性肝脏疾病的研究已经接近于临床，但是在胚胎肝脏前体细胞、胚胎干细胞以及诱导分化的多功能干细胞应用于人类前，关于安全性、有效性以及移植的位点还需要进一步研究。胰岛细胞与肝脏细胞在胚胎时期具有同样的起源。胰岛细胞移植也是目前仅有的能根据血糖变化反馈调节正常的胰岛素分泌，以达到长期稳定控制血糖目的的治疗手段。胰岛移植由于其创伤小，可重复替代破坏的内源性胰岛。胰岛能通过多种方式进行预处理降低免疫排斥反应和增强移植物功能。此外，胰岛移植不会像胰腺整体移植那样存在血栓形成和移植胰胰腺炎等潜在的并发症。自从Edmonton方案实施后，胰岛移植取得了巨大的进步，但由于免疫排斥的存在，5年胰岛素不依赖率仍较低。另外由于胰岛移植的方式是通过门静脉系统将胰岛注入肝脏门静脉系统，有潜在的门静脉栓塞、影响受体肝功能等并发症的危险。因此，也需要寻找一个新的移植位点一方面与目前成熟的已经应用于临床的肝脏注入方式结合，另一方面减少和降低并发症。细胞移植可以作为器官移植的备用选项，但大多数细胞的生长和增殖都需要特定的微环境和三维结构，组织工程学方法可以接近并达到这一条件。组织工程学方法的最终目标是重建组织或者器官，以此在生理上和功能上替代衰竭或受损的相应器官，发挥正常人体的器官功能。成功的组织器官工程学包括至少3个基本元素：一是组织特异性细胞，二是器官支架材料，三是要有适合组织形成的生长环境。目前在血管、膀胱以及气管等组织的工程化已经取得非常成功的进步。但是，对大器官如心脏、肺、肾脏以及肝脏等整个器官重建要求在移植后血液能迅速支持，这就需要重建或保持广泛的血管网络来运送营养物质和进行气体交换，使移植后的组织工程化的器官能得到营养供应和氧分支持。多种细胞在体外培养中通过去分化或者上皮-间质转化在几天内失去它们的形态和功能。这样侧面证明了微环境对维持细胞功能起着非常重要的作用。细胞外基质不仅仅给组织细胞提供支架，也调节它们的粘附、迁移以及分化、增殖和细胞存活，并且影响不同细胞间的作用。肝脏去细胞化的研究使从整体器官通过表面活性剂灌注器官而获得组织特异性的细胞外基质成为可能。与传统的去细胞方法将薄层的细胞组织浸入到不同的液体中获得去细胞的组织不同，整体肝脏器官去细胞支架维持了整体的血管网络床。这些血管网络系统不仅为目标类型的细胞通过传统路径再植提供可能，也为再植的细胞提供了三维的生长环境，而薄层的去细胞化组织只能提供二维的生长空间。于是，我们假设去细胞的肝脏支架(decellularized liver matrix，DLM)可能为细胞移植提供一个较为理想的微环境和支架结构。因此，本课题基于以上理论依据，进行了如下研究：第一部分去细胞化肝脏支架的获取目的：通过对多种方法的尝试，使用灌注法对小鼠的肝脏进行灌注去细胞化，检测去细胞化的肝脏的形态、结构，分析去细胞化肝脏的DNA含量，为进一步讲去细胞化肝脏用于细胞培养及移植中提供重要的理论基础和重要信息。方法：取成年BALB/c小鼠，在麻醉的状态下使用并优化门静脉灌注法的去细胞化程序，获取小鼠去细胞化的肝脏支架，对获取的肝脏支架进行HE染色和免疫组化染色，并将去细胞化的肝脏支架移植于裸鼠中，检测其血管生成情况。结果：1、使用优化的灌注法可以在较短时间内获得满意的去细胞化结果；2、去细胞化的肝脏支架DNA含量极低，达到去细胞化的效果；3、去细胞化的肝脏染色未见明显细胞组分和细胞核成分；4、去细胞化的肝脏保留了原有的血管支架和胶原成分；5、在小鼠中去细胞化的肝脏移植到肾脏包膜下能观察到血管生成。结论：通过优化的门静脉灌注法可以获得满意的肝脏支架，去细胞化肝脏可以作为良好的载体应用于体内及体外实验，为细胞培养提供三维结构，在体中可以加速血管生成，为待移植的细胞提供营养物质和氧分支持。第二部分去细胞化肝脏支架在肝前体细胞移植中的应用研究目的：获取肝脏前体细胞并鉴定，探讨去细胞化的肝脏支架是否能为肝脏前体细胞在体及体外生长、增殖提供组织相容性的三维生长环境。方法：分离小鼠胚胎14.5天的肝脏，获取肝脏前体细胞，使用逆转录病毒感染肝脏前体细胞使其可逆性永生化后将永生化的肝脏前体细胞灌注于去细胞化的肝脏支架中，观察其在体外培养2周和体内肾脏包膜下2周的生长增殖情况，并对相关影响因素进行探讨。并探讨其机制。结果：我们成功分离和构建了可逆的永生化的肝前体细胞株，该永生化的肝细胞株能在特定条件下向肝细胞分化，该细胞株在去细胞化的肝脏支架中能生长增殖，并诱导血管新生。同时该永生化的细胞株在体内及体外均未观察到潜在风险。在移植后2周，可观察到标记的种植于去细胞化的肝脏支架中的肝脏前体细胞在肾脏包膜下迅速增殖；免疫组化染色提示这些细胞具有肝细胞的部分功能，并观察到血管新生。EGF可以加强再植的永生化的肝脏前体细胞的增殖和分化。结论：使用逆转录病毒感染可以使肝脏前体细胞得到可逆性的安全的永生化状态，为肝脏细胞的大量获取提供了来源，去细胞化的肝脏支架可以为肝脏前体细胞提供赖以生长的三维环境和营养物质、氧分支持，EGF能促进肝脏前体细胞在肝脏支架中的分化和增殖，肝脏前体细胞作为细胞成分而肝脏支架作为理想的支撑材料能应用于肝脏细胞移植。第三部分去细胞化肝脏支架在胰岛移植中的应用研究目的：获取胰岛细胞并测定其功能，探讨胰岛细胞在去细胞化的肝脏支架中的在体生长情况。方法：使用胶原蛋白酶消化法以及非连续性梯度分离法获得成年小鼠的胰腺，纯化胰岛细胞，在体外检测胰岛细胞的功能后，将胰岛细胞灌注于去细胞化的肝脏支架中，观察其在肾脏包膜下的生长增殖情况。结果：使用胶原蛋白酶消化法可以获得大量的胰岛，大约为150-200个胰岛/小鼠。使用非连续性梯度分离法可以获得纯化的胰岛，这些胰岛在体外具有分泌胰岛素的功能。将胰岛细胞、种植于去细胞化肝脏中的胰岛细胞移植于糖尿病小鼠中，发现胰岛在去细胞化肝脏支架中能存活并发挥同普通胰岛肾脏包膜下移植同样的功能。结论：使用胶原蛋白酶消化法可以有效获得小鼠胰岛细胞，去细胞化的肝脏支架可以为胰岛细胞提供赖以生长的三维环境和营养物质、氧分支持，能作为理想的支撑材料应用胰岛细胞移植。