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研究背景及目的骨是恶性肿瘤最常累及的转移部位之一,骨转移的出现严重影响患者的生活质量,并常与不良预后相关。随着对骨转移发生机制及对骨微环境中“恶性循环”的深入了解,骨转移的治疗开启了新篇章。肿瘤细胞诱导的破骨细胞活性增强被认为是导致骨转移骨破坏的主要机制。肿瘤细胞于骨微环境内释放多种活性因子,包括PTHrP、 TNF-α、IL-1β、IL-6和RANKL等,它们可以直接作用于破骨前体细胞,或间接通过促进成骨细胞分泌RANKL激活破骨前体细胞内的NF-κB等通路,诱导破骨细胞活化,增强溶骨作用。艾拉莫德是一种抗风湿新药,临床前研究表明其具有抗炎、抗细胞因子、抑制NF-κB活性的作用。由于活化的破骨细胞是骨转移骨破坏的主要执行者,而炎症因子是骨微环境内增强破骨细胞活性的重要组分之一。我们推测艾拉莫德可能通过抗炎症因子及抑制破骨细胞激活的作用发挥对骨转移骨破坏的治疗效果。因此,我们拟分别在体内体外实验中研究艾拉莫德对骨转移骨破坏的影响及其可能的作用机制。实验方法1、建立大鼠胫骨肿瘤种植模型,研究艾拉莫德对乳腺癌骨转移骨破坏的影响。于大鼠左侧胫骨内接种大鼠乳腺癌Walker 256细胞建立肿瘤种植模型。分组给予安慰剂或艾拉莫德治疗。运用X线摄片、H&E染色的方法对大鼠胫骨骨破坏情况进行评价,运用TRAP染色对大鼠胫骨内破骨细胞活化水平进行检测,同时在模型建立前后检测大鼠左后肢机械痛阈的变化。2、体外培养破骨前体细胞,研究艾拉莫德对破骨细胞分化激活的影响及其机制。分离并培养小鼠骨髓单核巨噬细胞,加入RANKL诱导其向破骨细胞分化,同时予以艾拉莫德处理,用TRAP染色的方法检测艾拉莫德对破骨细胞分化的影响。Western blot免疫印迹法检测RANKL刺激后细胞内RANK受体下游NF-κB和MAPK通路的激活状态,以及转录因子c-Fos和NFATc1的表达水平。最后用qRT-PCR法检测细胞内NFATc1及其靶基因mRNA的表达水平。3、研究艾拉莫德对乳腺癌细胞炎症因子表达、细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响。qRT-PCR法检测艾拉莫德对人乳腺癌MDA-MB-231细胞炎症因子表达的影响,并运用Western blot免疫印迹法检测细胞内NF-κB p65的激活情况。随后在两种人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中检测艾拉莫德对其增殖、迁移、侵袭的影响。用CCK-8法检测艾拉莫德对细胞增殖的作用,流式细胞术检测艾拉莫德对两种细胞周期分布的影响,划痕实验及Transwell侵袭实验检测艾拉莫德对细胞迁移、侵袭的影响。实验结果1、完成给药后,大鼠左侧胫骨X线检查和H&E染色的结果显示接受艾拉莫德治疗的大鼠胫骨骨破坏程度较安慰剂组减轻,同时治疗后大鼠的左后肢机械痛觉过敏情况较安慰剂组改善。对大鼠左侧胫骨的TRAP染色发现艾拉莫德治疗组大鼠的胫骨内活化的破骨细胞数目少于安慰剂组。2、体外实验表明艾拉莫德显著抑制了破骨细胞的分化。并且细胞活力检测提示此抑制效应并非由艾拉莫德对细胞生长的抑制引起。信号通路的相关检测结果显示艾拉莫德显著抑制了RANKL诱导的破骨前体细胞内NF-κB和MAPK通路的激活,并下调了转录因子c-Fos和NFATc1的水平,减少了破骨细胞功能相关基因Cathepsin K、MMP-9和TRAP的表达。3、qRT-PCR和Western blot结果显示艾拉莫德使MDA-MB-231细胞表达TNF-α、IL-1β、IL-6的水平下降,但对RANKL的表达没有显著影响,同时药物处理后细胞内NF-κBp65的磷酸化水平也下降。此外,艾拉莫德只在高浓度(30μg/ml)时轻度抑制了MDA-MB-231以及MCF-7细胞的增殖,而与对照组相比,艾拉莫德对两种乳腺癌细胞的细胞周期分布、迁移和侵袭能力均没有显著影响。实验结论1、艾拉莫德使乳腺癌骨转移大鼠的骨破坏程度减轻,并使其机械性痛觉过敏症状得到一定改善。2、艾拉莫德缓解骨破坏的机制之一可能是其抑制了RANKL诱导的破骨前体细胞内NF-κB通路和MAPK通路的激活,从而下调了破骨细胞特异性基因的表达,影响了破骨细胞的活化,削弱了其溶骨作用。3、艾拉莫德缓解骨破坏的另一可能机制是通过NF-κB相关机制下调了乳腺癌细胞表达炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的水平,减少了骨微环境中激活破骨细胞的刺激因素,而不直接显著影响乳腺癌细胞RANKL的分泌、细胞的增殖、迁移和侵袭能力。