基于不相容性的大肠杆菌二元表达载体的构建及其应用

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本文选取来自鳗弧菌内源性独立质粒pEIBl复制子区片段,对其进行最小化及稳定性分析后,确定了最小稳定复制子。利用复制子不相容性的特点,发现其与ColEl,pSC101和p15A型复制子能够相容,构建了一个能与大肠杆菌常见克隆质粒相容的表达质粒pEC。该质粒使用特殊的阿拉伯糖启动子,通过控制诱导物L—阿拉伯糖的浓度,精确地控制目标基因的表达。 同时利用pEC质粒的特性,开发了一个用于研究DNA与蛋白质相互关系的双质粒表达系统,命名为大肠杆菌southwestern杂交系统。这个系统主要含有两个质粒,一个是由pEC衍生的表达质粒,表达目标蛋白;另一个是克隆lacZ基因的报告质粒,并在其上游引入人造lac启动子,这个启动子主要将-35和-10间隔区替换为待研究的目标DNA结合序列。一旦发生DNA与蛋白质结合,会导致下游报告基因在转录水平上的减少,即可通过精确的酶活分析确定其结合能力。 通过对精氨酸降解途径中的AdiY蛋白的研究分析,发现它能激活adiA基因的转录,可能与上游adiA启动子中的一段DNA序列结合。 尝试使用southwestern杂交系统进行AdiY蛋白的结合DNA功能的分析,发现在体内能够结合于目标DNA,有效的抑制下游报告基因的转录,在培养基上有明显的颜色变化。利用毛细管电泳技术,在体外进行分析,证明AdiY蛋白与adiA启动子发生特异性结合,具有结合DNA及激活AdiA蛋白的功能。
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