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目的:掌握人脂肪源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的分离、培养方法,并探讨其部分生物学特性。探讨纤维蛋白胶对ADSCs增殖的影响。构建一种新型可注射型生物支架材料,为临床修复软组织缺损奠定实验基础。方法:1.取脂肪抽吸术的脂质部分,用酶消化法分离获得ADSCs。倒置显微镜下观察ADSCs体外培养形态学改变。利用MTT法检测原代细胞活性并绘制细胞生长曲线;第3代(P3)细胞分别加入含胰岛素、甲基黄嘌呤(IBMX)、地塞米松、吲哚美辛的条件培养基和含地塞米松、磷酸甘油、维生素C的条件培养基进行定向诱导分化成脂、成骨。油红O染色、茜素红染色定性,镜下观察ADSCs变化。2.体外培养人ADSCs,取P3细胞接种到96孔板,以不同浓度(纤维蛋白原与凝血酶比例:4∶1、2∶1、8∶3、5∶2)纤维蛋白胶浸润提取液培养,用MTT法检测ADSCs在不同浓度纤维蛋白胶上的增殖情况。3.体内实验分5组:A组:单纯纤维蛋白胶组,选用低浓度(纤凝比4:1)纤维蛋白胶;B组:单纯纯化后的脂肪颗粒组;C组:单纯ADSCs组,细胞浓度为3×106/ml;D组:细胞-脂肪复合物,细胞浓度为3×106/ml与纯化后的脂肪颗粒1:1混合;E组:细胞-支架复合物,细胞浓度为3×106/ml与纤维蛋白胶1:1混合。每组0.3ml分别注射至裸鼠背部皮下,5点/只,共10只。观察各组植入后,裸鼠的生命体征及局部变化,8周后取出,分别进行体积、湿重测定、HE染色等分析。结果:原代细胞显示3-4h开始贴壁,最初呈类圆形,2-4d逐渐延伸,呈典型成纤维细胞。5d左右进入对数生长期,2-3周单层细胞融合率可达90%左右,细胞排列紧密成旋涡状。传代后2-4h开始贴壁,增殖迅速,2-4d即可达80%。一般3-8代细胞增殖活跃,之后稍减弱。P3细胞分化成脂、成骨,油红O染色镜下可见细胞中间有脂滴,茜素红染色可见椭圆形结节状结构。不同浓度纤维蛋白胶制备的浸润提取液所培养的ADSCs生长曲线无明显差异。本次实验10只裸鼠,植入复合物后生命体征平稳,注射部位未见明显炎症反应,B、D、E组均可见新生组织形成,A、C组未见组织。大体观察,B组和D组可见明显脂肪颗粒,E组可见新生组织,但略少于B、D组。HE染色B、D、E组均可见脂肪细胞,D组富含胶原蛋白及脂肪颗粒。体积:D组>B组>E组;湿重:D组>B组>E组。结论:构建了一种简单有效的体外分离和培养ADSCs的方法,ADSCs生长旺盛、增殖快,具有多向分化潜能,可以作为组织工程理想的种子细胞。不同浓度纤维蛋白胶对ADSCs的增殖无明显影响,纤维蛋白胶有望成为ADSCs生长的支架材料。ADSCs能在纤维蛋白胶上黏附、生长,纤维蛋白胶可以作为ADSCs的载体和组织工程支架材料。