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目的：
YAP1(Yes-associatedproteinl)是Hippo-YAP信号转导通路下游的一个转录激活因子，能够调节细胞增殖和凋亡，调节上皮间质转化和细胞间接触。近年来发现其在多种恶性肿瘤中表达上调。本研究选择高表达YAP1基因的胃癌细胞系BGC823作为研究对象，通过RNAi方法沉默YAP1基因表达来观察其对BGC823细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭等恶性生物学行为的影响，并探讨其相关分子机制。
材料与方法：
1、设计合成两条针对靶基因YAP1 mRNA的干扰序列，将其插入到pRFP-C-RS载体中，经酶切和测序鉴定所构建的重组体是否正确;
2、采用脂质体转染法，分别将两个重组质粒和pRFP-C-RS空质粒转染至BGC823人胃癌细胞中，应用qRT-PCR方法检测重组质粒的干扰效率。本实验选择最有效的干扰质粒用于稳定转染胃癌细胞，以pRFP-C-RS作为空载阴性对照。利用嘌呤霉素抗性筛选出稳定表达干扰序列的单克隆胃癌细胞扩大培养。采用qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光方法检测RNAi后BGC823胃癌细胞的YAP1mRNA和蛋白表达量，筛选出沉默效率最高的YAP1shRNA-BGC823细胞株。
3、应用MTT比色法、平板克隆形成实验检测沉默YAP1基因的表达对BGC823胃癌细胞增殖能力的影响。
4、应用划痕实验和Transwell迁移实验检测沉默YAP1基因的表达对BGC823胃癌细胞体外迁移能力的影响。
5、应用Transwell侵袭实验检测沉默YAP1基因的表达对BGC823胃癌细胞体外侵袭能力的影响。
6、采用Western blot法检测沉默YAP1表达对E-cadherin、Vimentin、α-catenin、β-catenin、MMP2、MMP9等EMT相关蛋白表达的影响。
7、采用Western blot法检测total-AKT和pho-AKT、total-ERK1/2和pho-ERK1/2、SP1和VEGF的表达。
8、统计学方法
结果数据以mean±SD表示，采用spss17.0软件进行统计学处理，采用单因素方差分析对实验结果进行差异显著性分析。检验水准a=0.05。
实验结果：
1、重组YAP1shRNA干扰质粒经测序鉴定构建成功。
2、重组质粒介导的YAP1shRNA有效沉默了BGC823胃癌细胞YAP1基因的mRNA和蛋白的表达。
3、MTT和克隆形成实验结果显示，沉默YAP1基因的表达明显抑制了BGC823胃癌细胞的增殖能力和克隆形成能力。
4、细胞划痕实验和Transwell迁移实验结果显示，沉默BGC823胃癌细胞YAP1基因的表达后明显抑制了其在体外的迁移能力。
5、Transwell侵袭实验结果表明，沉默BGC823胃癌细胞YAP1基因的表达明显抑制了其在体外的侵袭能力。
6、沉默YAP1基因的表达后，BGC823胃癌细胞中E-cadherin和α-catenin蛋白表达增加，而Vimentin、β-catenin和MMP9蛋白表达降低，MMP2表达无变化。
7、沉默YAP1基因的表达后，BGC823细胞中total-AKT和total-ERK1/2蛋白表达无变化，但pho-AKT、pho-ERK1/2表达下调。沉默YAP1基因的表达后，BGC823细胞中VEGF蛋白表达降低，而SP1蛋白表达无明显变化。
结论：
沉默YAP1基因的表达能明显抑制BGC823胃癌细胞的增殖和克隆形成能力，其机制可能是通过抑制ERK1/2和PI3K-AKT信号通路的活性起作用;沉默YAP1基因可明显抑制BGC823胃癌细胞的迁移和侵袭能力，其机制可能与上调E-cadherin和α-catenin、下调Vimentin、β-catenin、MMP9蛋白表达，进而抑制胃癌细胞的EMT有关。此外，沉默YAP1基因可明显下调VEGF表达，但对SP1表达无明显影响，提示YAP1基因对VEGF的调控可能主要是通过SP1以外的其他途径发挥作用。