研究背景及目的肿瘤是威胁人类生命健康的重大复杂疾病,尽管手术、放疗及化疗被广泛用作肿瘤治疗的常规手段,但在杀伤肿瘤细胞的同时,也会对正常组织和细胞产生损伤。因此寻找更为有效的综合治疗方法尤为重要。5-氨基酮戊酸介导的光动力疗法（5-aminolevulinic acid-based photodynamic therapy,5-ALA-PDT）目前常用于治疗多种浅表肿瘤。5-ALA作为新型光敏剂,是血红素合成的前体化合物,可被肿瘤组织特异性地吸收,经过体内血红素合成的一系列代谢过程,转变为原卟啉Ⅸ（Protoporphyrin IX,PpⅨ）。PpⅨ具有较强的光敏作用与荧光特性,经过特定波长的光照射激发,在组织内分子氧的参与下产生强烈的光动力化学反应,生成单线态氧分子及某些自由基等活性氧物质,破坏组织内的蛋白质、核酸等多种生物大分子物质,促使肿瘤细胞凋亡或者坏死,从而达到治疗目的。然而影响光动力效应的因素有多种,除了光和氧分子外,光敏剂在细胞内高浓度的积累是重要的前提。理想的光敏剂应能较强地特异积蓄于肿瘤细胞内,短时间达到高峰,且靶细胞内的光敏剂浓度与正常组织差别越大越好。因此深入探究肿瘤细胞选择性积累的作用机制,对于如何提高肿瘤细胞内光敏剂浓度,并提高光激发后的活性氧含量,从而增强PDT疗效,具有重要价值。研究结果证实5-ALA通过主动运输进入细胞内,细胞系不同其参与转运的蛋白分子也不尽相同。在神经元等多种细胞中5-ALA通过γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）转运蛋白（GATs）进行跨膜转运。作为蛋白4.1家族的成员,细胞膜骨架蛋白4.1R能将跨膜蛋白与血影蛋白-肌动蛋白复合体连接,在维持细胞的正常结构形态、细胞分裂及信号转导等功能上起到重要的作用。课题组前期研究中发现,与野生型(4.1R^+/+)小鼠胚胎成纤维（MEF）细胞相比,4.1R基因敲除型(4.1R^-/-)的MEF细胞对5-ALA-PDT的敏感性降低,细胞内积累的PpⅨ下降,而5-ALA代谢过程并没有受到影响,提示蛋白4.1R的缺失影响了5-ALA在细胞中的跨膜转运,进而降低了5-ALA-PDT的杀伤效果。本研究以4.1R基因敲除的MEF细胞为模型,探讨蛋白4.1R参与转运5-ALA的作用与机理,同时利用本课题组已成功构建的野生型(4.1R^+/+)与4.1R基因敲除型(4.1R^-/-)小鼠肥大细胞瘤（P815）细胞系,探索在肿瘤细胞中蛋白4.1R对光动力效应的影响,从而为探索提高光动力疗法的方法提供理论依据。研究方法1.4.1R^+/+与4.1R^-/-MEF细胞进行5-ALA与不同浓度的GABA转运体GAT1、GAT2与GAT3的特异性抑制剂共同孵育,PDT处理后,CCK-8法检测细胞存活率。2.4.1R^+/+与4.1R^-/-MEF细胞同时孵育5-ALA及最佳抑制浓度的GAT1-3抑制剂,荧光分光光度计检测两种细胞内PpⅨ的积累量;多功能酶标仪检测PDT处理后细胞内的活性氧（ROS）含量。3.荧光定量PCR检测4.1R^+/+与4.1R^-/-MEF细胞内GAT1-3的基因表达量;Western blot检测两种细胞内GAT1与GAT2的蛋白表达情况;细胞免疫荧光法检测GAT1与GAT2在MEF细胞中的定位。4.免疫共沉淀技术检测蛋白4.1R与GAT1、GAT2之间存在的相互作用。5.CCK-8法检测4.1R^+/+与4.1R^-/-P815细胞在不同5-ALA浓度、孵育时间以及不同光照剂量条件下,PDT作用后两种细胞的存活率情况。6.荧光分光光度计检测4.1R^+/+与4.1R^-/-P815细胞孵育5-ALA后,细胞内PpⅨ的积累量;多功能酶标仪检测5-ALA-PDT作用后两种细胞内的活性氧含量。7.荧光分光光度计检测4.1R^+/+与4.1R^-/-P815细胞提前孵育能量抑制剂后,细胞内PpⅨ的积累量。研究结果1.CCK-8法检测细胞存活率,结果显示加入GAT1抑制剂Tiagabine、GAT2抑制剂NNC 05-2090后,4.1R^+/+与4.1R^-/-MEF细胞的存活率均明显增加,在Tiagabine浓度为7.5μM、NNC 05-2090浓度为2μM时,抑制效果最明显（P<0.001）;GAT3抑制剂（S）-SNAP-5114的加入对PDT处理后细胞的存活率基本无影响。2.荧光分光光度计及多功能酶标仪检测结果显示,相比GAT1抑制剂,加入GAT2抑制剂后两种细胞内PpⅨ积累量与活性氧含量显著降低（P<0.001）,GAT3抑制剂对PpⅨ积累量及活性氧含量基本无影响。3.荧光定量PCR结果显示,相比4.1R^+/+MEF细胞,4.1R^-/-MEF细胞中GAT1基因表达量明显降低（P<0.01）,GAT2基因的表达水平也显著下降（P<0.001）,而GAT3基因的表达水平并没有明显变化。Western blot结果显示,与4.1R^+/+MEF细胞相比,4.1R^-/-MEF细胞内GAT1与GAT2蛋白表达均明显降低。细胞免疫荧光结果显示GAT1与GAT2定位于MEF细胞膜表面。4.免疫共沉淀结果显示,蛋白4.1R与GAT1、GAT2之间存在相互作用。5.CCK-8法检测结果显示,5-ALA-PDT对4.1R^+/+与4.1R^-/-P815细胞的杀伤效果与5-ALA浓度、孵育时间以及光照剂量相关,在5-ALA浓度为0.7m M,孵育3h,光照剂量为90m J/cm2时,4.1R^+/+与4.1R^-/-P815细胞存活率分别为22.4%±3.1与51.1%±3.3,差异显著（P<0.001）。6.荧光分光光度计结果显示4.1R^+/+与4.1R^-/-P815细胞内PpⅨ积累量随5-ALA浓度的增加而上升,在0.7m M处,4.1R^+/+P815细胞内PpⅨ荧光强度显著高于4.1R^-/-P815细胞（P<0.001）。多功能酶标仪检测结果显示4.1R^+/+P815细胞内活性氧含量显著高于4.1R^-/-P815细胞（P<0.001）。7.荧光分光光度计结果显示加入能量抑制剂后,4.1R^+/+与4.1R^-/-P815细胞内产生的PpⅨ含量显著降低（P<0.001）,表明5-ALA是通过主动运输的方式进入P815细胞。研究结论1.在MEF细胞中,5-ALA通过GAT1与GAT2进行跨膜转运,其中GAT2起主要作用。2.蛋白4.1R参与了GAT1、GAT2对5-ALA的转运,进而影响了5-ALA-PDT的效果。3.在肿瘤细胞P815细胞中,蛋白4.1R的缺失影响了细胞对5-ALA-PDT的敏感性,降低了PDT的效率。