冠状动脉微栓塞(CME)是急性冠脉综合征及冠状动脉介入治疗中十分常见且重要的临床事件,积极防治CME具有重要的临床意义。除了在急性期使用GPIIb/IIIa受体拮抗剂及远端血管保护装置外,目前缺乏对CME后续及慢性期有效的干预策略。炎症反应在CME发生、发展中起重要作用,NF-κB是关键的前炎性转录因子。因此本研究尝试利用大鼠自体血栓微粒造成心肌内小冠脉栓塞,建立大鼠CME模型,旨在:(1)探讨炎症反应及核因子-κB(NF-κB)在CME后心肌损害中的作用及机制;(2)评价NF-κB抑制剂干预对CME后心肌炎症反应及心功能的影响。一、大鼠冠状动脉微栓塞模型的建立目的:采用自体微血栓创建一种操作性强且贴近临床的大鼠CME模型。方法:采用清洁级健康雄性SD大鼠120只,体重280～320 g。随机分为假手术组(n=24)、CME组(n=96);CME组依所注射的血栓剂量分为3mg(CME3)、5mg(CME5)、7mg(CME7)组;并根据不同观察时间点再分为术后1、3、7、14天(d)4个亚组,每亚组8只。术前36小时尾静脉取血1ml,于37℃温箱内形成血凝块,匀浆器研碎血凝块后用38μm筛孔过筛后备用。假手术组即左心室腔内注射PBS 0.3ml;而微栓塞组注入微血栓制成的混悬液。采用ELISA法检测术后1d血清肌钙蛋白I(cTnI)的水平。HE、HBFP及Masson染色观察CME术后1d及14d心肌组织病理学改变;超声心动图、血液动力学检测大鼠心功能变化。结果:(1)假手术组24只大鼠全部存活。CME3、CME5及CME7组分别死亡3只(9%)、7只(22%)、19只(59%),CME7组存活者均表现为不同程度的精神委靡、呼吸困难、活动及进食减少等。(2)HE、HBFP染色显示CME各组可见多中心小灶性心肌缺血、坏死伴白细胞浸润。CARSTAIRS染色进一步证实心肌微小动脉内(<100μm)有散在的血栓形成。Masson染色显示CME后14d心肌微小纤维灶形成,且多分布于心内膜区。与假手术组相比,CME各组微梗死面积显著增加,分别是:(7.27±1.00)%、(16.70±2.07)%、(21.51±1.98)% (P<0.01)。(3)CME各组左室收缩、舒张功能降低伴cTnI水平升高,并随着微血栓剂量增大而更加明显(P<0.01)。结论:经左心室内注射自体微血栓5mg、同时短暂主动脉夹闭可建立稳定、重复性好且模拟人体病变的大鼠冠状动脉微栓塞模型,适于进行冠状动脉微栓塞病理生理机制的研究。二、炎症反应在冠状动脉微栓塞后心肌损害中的作用及机制目的:探讨CME后炎症反应及NF-κB激活在心肌损害中的作用及机制。方法:清洁级雄性SD大鼠56只,体重280～320 g,分为假手术组( n = 24)、微栓塞组( n =32,模型复制同第一部分),分别于术后1、3、7、14d处死。原位杂交组织化学染色检测TNFα、IL-6、ICAM-1 mRNA在心肌中的空间分布及动态变化,Real-Time PCR检测其表达含量。以免疫组织化学染色、Western blot测定不同时间点心肌细胞TNFα、IL-6、ICAM-1、IκBα的表达水平。应用免疫组织化学染色明确NF-κB P65核定位,电泳迁移率改变分析(EMSA)检测心肌组织NF-κB DNA结合活性。Tunel法检测心肌细胞凋亡,超声多普勒、血液动力学指标用于评定心功能。结果:(1)TNFα、IL-6、ICAM-1 mRNA及蛋白在正常大鼠心肌细胞及血管弱表达或无表达。CME后TNFα、IL-6 mRNA及蛋白在微梗灶内残留的和周边区缺血的心肌细胞、非梗塞血管内皮及部分“正常”心肌细胞均表达增强。ICAM-1 mRNA及蛋白在微梗塞周边心肌、非梗塞血管内皮出现表达增强。IOD值分析心肌组织ICAM-1的表达与白细胞浸润程度呈明显正相关(r=0.722, P<0.01)。Western blotting显示,CME组在不同观察时间点心肌TNFα、IL-6、ICAM-1较假手术组均明显增强;CME后3-7d是TNFα、IL-6、ICAM-1的表达高峰阶段。(2)免疫组化还显示血管壁炎性细胞游走、渗出明显,小血管内出现白细胞黏附、聚集,造成小血管堵塞。(3)NF-κB DNA结合活性在CME后1d增高,3d时达到高峰;7d时明显降低,14d时与假手术组无显著性差异;并且NF-κB P65活化定位于心肌细胞核。CME组于术后1、3d心肌细胞胞质IκBα表达明显弱于假手术组,术后7、14d基本回升至假手术组水平。(4)NF-κB DNA结合活性与TNFα、IL-6、ICAM-1三种细胞因子的mRNA表达水平均呈显著正相关(分别是r=0.72,P<0.05;r=0.94, P<0.01; r=0.62, P<0.05)。(5)CME组在各观察时间点心肌细胞凋亡指数均明显高于假手术组。(6)急性期TNFα表达含量与左室收缩功能指标(LVdp/dt max,EF)呈显著负相关(分别是r=-0.77,P<0.01;r=-0.65,P<0.01)。结论:(1)CME心肌炎症反应不仅局限于微梗灶及周围,同时在许多非梗塞血管也出现炎症细胞明显激活,并波及到许多“无辜心肌”,产生“旁观者效应”。(2)CME后IκBα降解导致NF-κB激活,NF-κB激活促使炎性因子TNFα、IL-6、ICAM-1在基因及蛋白水平明显上调,是诱导CME炎症反应中的重要早期事件。三、NF-κB抑制剂PDTC对大鼠冠状动脉微栓塞后心肌炎症及心功能的影响目的:探讨特异性NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)对大鼠CME后心肌炎症反应的影响,进一步明确NF-κB激活在CME中的作用。方法: SD大鼠152只,体重280-320g;24只为假手术组;余128只随机分为1、CME组(生理盐水腹腔注射1/日);2、P200(PDTC 200 mg.kg-1.day-1);3、P100组(PDTC 100 mg.kg-1.day-1);4、P50组(PDTC 50 mg.kg-1.day-1)。各处理组均为术前1小时通过腹腔注射给药,持续至术后7d,分别于1、3、7、14d处死。以光镜下微梗死面积、白细胞浸润程度的测定及血清cTnI水平作为CME心肌损伤的指标;Masson染色检测心肌细胞间质胶原纤维含量。应用电泳迁移率改变分析(EMSA)检测心肌组织NF-κB的DNA结合活性,免疫组化、Western blotting测定不同治疗组心肌细胞胞浆TNFα、IL-6、ICAM-1、IκBα的表达水平,Real-Time PCR检测其心肌TNFα、IL-6、ICAM-1 mRNA的动态表达,Tunel法检测心肌细胞凋亡率,超声多普勒、血液动力学指标评定心功能。结果:(1)PDTC可显著减少微梗死面积及心肌中白细胞浸润、降低血清CTnI水平,并抑制心肌间质胶原纤维增生(P<0.01),P100、P200较P50组明显(P<0.05),P100与P200组之间无显著性差异(P>0.05)。(2)PDTC明显降低NF-κB DNA结合活性(P<0.05),P50、P100、P200组随着剂量增大抑制作用增强;并能显著减少1、3d时IκBα蛋白的降解;在7d IκBα蛋白的表达高于假手术组(P<0.05),14天时各组无差异。(3)PDTC明显抑制TNFα、IL-6、ICAM-1mRNA及蛋白表达,对TNFα、IL-6而言,其作用随剂量增大而增强;对ICAM-1则不同,P200较P100组在不同时间点均无进一步抑制ICAM-1mRNA,其表达水平与P100组接近,甚至轻度升高。(4)PDTC可明显减少心肌细胞凋亡率;P200组在术后7d时出现心肌细胞凋亡率较P100增多(P<0.05),停药后7d两组无显著性差异。(5) PDTC可改善左室收缩、舒张功能,P100、P200较P50组明显(P<0.05),P100与P200组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:CME后PDTC通过抑制NF-κB P65及其转录系统的激活,可显著减少心肌组织炎症介质过度产生及炎症反应过度放大;PDTC抑制炎症反应的效果呈现一定的剂量依赖性,增大剂量可能进入平台期,甚至出现细胞凋亡增多等反作用;PDTC抑制CME后心肌组织的炎症反应可转化为心肌及心功能保护作用。