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锌是植物所必需的微量元素,在植物体内的许多生化反应中都起着重要作用。锌不仅是许多酶的辅助因子,同时还是植物体内重要蛋白质结构的辅助因子,它不仅参与机体的各种代谢,在生物膜稳定和基因表达等生理机能中也担负重要角色。玉米是对锌反应比较敏感的作物之一。缺锌时,玉米植株体内生长素合成受阻,严重时显著地降低玉米的产量。植物体内的自动调节平衡机制会调节金属离子的吸收和运输,从而控制金属离子的含量。锌铁调控蛋白ZIP(ZRT,IRT-likeprotein)家族是广泛存在于植物中的转运蛋白,具有Ca2+、Fe2+、Mn2+及Zn2+等多种金属元素的转运功能。了解ZIP蛋白在植物中如何发挥离子转运功能,从而提高植物对锌的吸收及积累有着重要的意义。本研究通过转基因的方法,将ZmZIP4基因转化玉米自交系Hi-Ⅱ,鉴定该基因的作用和改善玉米对锌吸收的能力,主要研究结果如下:
(1)对农系531、农系85、P53、BS110、吉853、郑58进行愈伤筛选,发现农系85利用改进的培养基能诱导出Ⅱ型愈伤组织,并可成苗。
(2)在pr754载体基础上构建了玉米胚乳特异性表达载体pr-ZmZIP4,并将该载体表达核与Bar基因表达核混合后通过基因枪共转化,得到4块抗性愈伤,经目的基因与Bar基因的双重PCR检测后,其中3块为含有目的基因的阳性愈伤。
(3)在pCAMBIA3301载体基础上构建了转化玉米的超表达载体pC3301-ZmZIP4,得到了7块抗性愈伤,PCR检测阳性。qRT-PCR实时荧光定量PCR分析检测到ZmZIP4基因在转基因植株中超量表达。
(4)对pC3301-ZmZIP4转化后的愈伤在成苗过程中进行梯度的低锌胁迫,观察不同浓度下胚状体成苗的形态变化,表明ZmZIP4对锌的吸收起着重要的作用。