论文部分内容阅读
X射线属于电离辐射的一种,在医学中有着广泛的应用,骨科疾病患者常常需要接受多次X射线的照射,而辐照的剂量属低剂量范围以内。低剂量X线辐照离体成骨母细胞,发现可以促进成骨细胞增殖、分化过程,从而加速骨折愈合,但其具体机制尚不清楚。我们的前期研究使用基因芯片技术发现低剂量X线照射会促进与细胞骨架相关基因的表达,可能通过细胞外基质-局部粘附-细胞骨架途径参与低剂量X线照射促进成骨细胞增殖、分化过程。目前,有关低剂量X线照射对成骨细胞骨架的研究还比较少。低剂量X线照射成骨细胞后,肌动蛋白细胞骨架的变化情况及机制尚不明了。本研究采用医用直线加速器对成骨细胞进行0Gy(对照组)、0.5Gy(低剂量组)、5Gy(高剂量组) X线照射,观察成骨细胞在X线照射后细胞内微结构及纤维肌动蛋白的变化,通过Real-TimePCR及Westtern blot技术检测胞内RhoA/ROCK、cofilin及其磷酸化水平变化,探讨低剂量X线照射参与成骨前体细胞骨架重构的机制,以及细胞骨架重构对成骨细胞增殖分化的影响,为进一步认识低剂量电离辐射的生物学效应提供理论依据。本实验分为三部分:实验一:不同剂量X线照射对成骨细胞形态及肌动蛋白细胞骨架重构的影响目的:观察不同剂量X线照射作用于成骨细胞后,细胞形态、胞内微结构及纤维肌动蛋白的变化情况,为进一步研究低剂量X线照射引起成骨细胞肌动蛋白骨架重构的机制提供实验基础。方法:从中国科学院细胞库购得MC3T3-E1细胞,采用医用直线加速器以0Gy、0.5Gy、5Gy(剂量率为200cGy/min)作用成骨细胞后,用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化,透射电镜观察细胞内微结构变化以及FITC-phalloidin对各实验组细胞的F-actin进行染色,荧光显微镜下观察各实验组肌动蛋白细胞骨架的变化。结果:0.5Gy、5Gy组细胞的F-actin在照射后2h后遭到破坏,且随着辐射剂量的增加破坏程度越严重,呈剂量依赖性。但24h后细胞肌动蛋白骨架发生重构, F-actin染色逐渐增强、纤维增粗,照射后第3天时最为显著,但至第5天时F-actin染色逐渐恢复正常,与0Gy组接近。结论:X线辐射短时间内能使成骨前体细胞骨架破坏、F-actin解聚,但随后细胞肌动蛋白骨架发生重构,F-actin表达增强,至第5d时逐渐恢复正常。实验二:RhoA/ROCK信号通路在介导低剂量X线照射引起成骨细胞肌动蛋白细胞骨架重构中的研究目的:研究RhoA/ROCK信号通路在低剂量X线照射引起肌动蛋白细胞骨架重构中的作用。方法:采用医用直线加速器以0Gy、0.5Gy、5Gy作用成骨细胞后,以Real-TimePCR及Westtern blot技术检测细胞内RhoA、 ROCK、 cofilin及磷酸化cofilin(phospho-cofilin)水平变化。随后以ROCK激酶特异性抑制剂Y27632预处理成骨细胞,观察X线照射后细胞肌动蛋白骨架变化情况。结果:成骨细胞经0.5、5Gy X线照射后1天,各实验组RhoA、ROCK、phospho-cofilin含量开始升高,第3天变化最为明显,直至5天后各实验组RhoA、ROCK、phospho-cofilin含量趋于下降。Y27632预处理组细胞肌动蛋白骨架遭到破坏,肌动蛋白纤维排列稀疏紊乱,阻断了低剂量X线照射引起的细胞骨架重构。结论:低剂量X线照射可以通过RhoA/ROCK信号通路引起成骨细胞肌动蛋白骨架重构。实验三:抑制细胞骨架重构对低剂量X线作用下成骨细胞增殖分化的影响目的:研究RhoA/ROCK信号通路在低剂量X线照射促进成骨细胞增殖分化过程中的作用。方法:在对成骨细胞进行低剂量X线照射前,使用ROCK激酶特异性抑制剂Y-27632预处理细胞,随后以CCK-8、ALP活性检测、茜素红钙结节染色、Western blot技术检测经0.5GyX线照射后成骨细胞的增殖、分化情况。结果:使用ROCK激酶抑制剂Y27632处理细胞后可以阻断低剂量X线照射促成骨细胞增殖、分化作用。+Y276320.5Gy组细胞各项成骨分化指标降低,与0Gy组相比无明显差异。结论:RhoA/ROCK信号通路参与低剂量X线照射促进成骨细胞增殖、分化的作用。