【摘 要】
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目的:明确17-β雌二醇(E2)对乳腺癌细胞Pokemon表达的影响,初步探讨ERα调控Pokemon表达的分子机制。方法:本实验分为五部分:(1)以乳腺癌细胞MCF-7为研究对象,加入不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6 mol/L)E2刺激4h,采用免疫印迹法(Western Blot)分析细胞ERα、Pokemon蛋白的变化。随后选择10-8 mol/L E2刺激MCF-7细胞1
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目的:明确17-β雌二醇(E2)对乳腺癌细胞Pokemon表达的影响,初步探讨ERα调控Pokemon表达的分子机制。方法:本实验分为五部分:(1)以乳腺癌细胞MCF-7为研究对象,加入不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6 mol/L)E2刺激4h,采用免疫印迹法(Western Blot)分析细胞ERα、Pokemon蛋白的变化。随后选择10-8 mol/L E2刺激MCF-7细胞1h、2h、4h,采用免疫印迹法和实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析MCF-7细胞ERα、Pokemon蛋白和mRNA转录水平的变化。(2)MCF-7细胞分别瞬时转染ERαsiRNA-1、ERαsiRNA-2、ERαsiRNA-3,采用免疫印迹法检测ERαsiRNA的沉默效应并筛选ERα特异性的siRNA。(3)MCF-7细胞瞬时转染ERαsiRNA-3,采用免疫印迹法分析细胞Pokemon蛋白的变化。(4)MDA-MB-231细胞瞬时转染ERα质粒,采用免疫印迹法分析细胞Pokemon蛋白的变化。(5)将Pokemon启动子质粒及ERαsiRNA-3瞬时共转至MCF-7细胞,应用双荧光素酶报告基因实验分析ERαsiRNA-3对Pokemon启动子活性的影响。将Pokemon启动子质粒及ERα质粒瞬时共转至MDA-MB-231细胞,应用双荧光素酶报告基因实验分析ERα质粒对Pokemon启动子活性的影响。结果:1.Western Blot检测证实加入10-8、10-7 mol/L E2刺激MCF-7细胞4h,细胞ERα、Pokemon蛋白水平与对照组相比均下降。在MCF-7细胞加入10-8 mol/L E2刺激1h、2h、4h,通过Western Blot、qRT-PCR发现E2刺激2h、4h后细胞ERα、Pokemon蛋白和mRNA转录水平均下降。2.在MCF-7细胞,ERαsiRNA-3具有较好的ERα沉默效应。3.MCF-7细胞沉默ERα后,Western Blot检测细胞Pokemon蛋白水平下降。4.MDA-MB-231细胞过表达ERα后,可增加Pokemon蛋白表达水平。5.通过双荧光素酶报告基因活性实验发现沉默ERα可抑制MCF-7细胞Pokemon启动子活性,过表达ERα可增加MDA-MB-231细胞Pokemon启动子活性。结论:E2可抑制乳腺癌细胞Pokemon mRNA转录和蛋白表达,其机制与ERα调控Pokemon启动子活性有关。
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