疟疾是严重危害人类身体健康的虫媒传染病,世界卫生组织(WHO)已将疟疾和艾滋病、结核病一起,列为全球三大公共卫生问题。媒介控制是疟疾综合防治措施的重要组成部分,而媒介控制措施的效果很大程度上依赖于相关媒介调查资料的准确性。传疟媒介的种类、密度、嗜血习性以及其传疟能力等疟疾传播动力学信息,是媒介调查的重要内容和实施综合媒介控制措施所需的科学依据。随着分子生物学技术的不断发展,目前虽已发展了按蚊种群及种下分类鉴别的基因检测技术,但按蚊子孢子检测和按蚊人血指数测定仍依赖于传统的显微镜解剖和血清学检测方法,其操作较为繁琐,敏感性和特异性均有一定的限制,已不适合当前大规模疟疾媒介调查的需要。为此,本研究立足于疟疾现场防治中媒介调查的需要,研究建立可用于按蚊人血指数基因检测和按蚊体内子孢子基因检测的技术。研究包括二部分内容:第一部分:按蚊人血指数基因检测技术的研究目的:建立按蚊人血指数基因检测技术。方法:根据人核糖体DNA(rDNA)序列设计一对特异性引物,采用聚合酶链式反应(PCR)方法,检测不同来源血样DNA以及吸饲人血不同时间(1h、6h、12h、18h、24h、27h、30h、33h、36h、40h、44h和48h)按蚊胃血DNA,研究采用按蚊人血指数基因检测技术的特异性和敏感性。结果:1新建立的按蚊人血指数基因检测技术可从人血DNA中扩增得到519bp大小的特异性DNA条带,而对其它动物来源血样DNA及未吸血按蚊DNA均不能扩增出特异性条带。2吸人血24h内的所有吸血中华按蚊胃血均能扩增出特异性DNA条带,而在吸人血27h、30h、33h和36h后的各5只吸血中华按蚊中,分别只有4、4、2、1只吸血中华按蚊胃血能扩增出特异性DNA条带,吸血40h后的所有吸血中华按蚊胃血均不能扩增出特异性条带。3 Logistic回归分析表明,吸血后24～40h,基因检测阳性按蚊数与吸血后的时间呈负相关关系(p<0.01)。结论:新建立的按蚊人血指数基因检测技术可准确鉴定吸血24h内的中华按蚊胃内的人血,可替代传统免疫学方法用于媒介调查按蚊人血指数的测定。第二部分:蚊体内疟原虫子孢子基因检测技术的研究I:SYBR Green I染料法实时荧光定量PCR检测和鉴别疟原虫子孢子方法的建立目的:建立一种采用SYBR Green I染料法实时荧光定量PCR技术检测和鉴别蚊体内疟原虫子孢子的方法。方法:根据针对4种人体疟原虫18S rDNA基因种特异性区域两侧保守区的基因序列设计一对引物,建立SYBR Green I染料法实时荧光定量PCR检测蚊体内疟原虫子孢子的方法。以本实验室构建的间日疟原虫18S rDNA重组质粒pGEM-V为模板,进行实时荧光定量PCR反应优化;以不同稀释度间日疟原虫18S rDNA重组质粒与阴性按蚊DNA的混合物为模板,制作荧光定量PCR检测标准曲线,并进行检测敏感性研究;以本实验室构建的4种人体疟原虫特异的18S rDNA重组质粒(间日疟原虫18S rDNA重组质粒pGEM-V、恶性疟原虫18S rDNA重组质粒pGEM-F、卵形疟原虫18S rDNA重组质粒pGEM-O和三日疟原虫18S rDNA重组质粒pGEM-M)和以本实验室饲养的3种按蚊(中华按蚊、嗜人按蚊和斯氏按蚊)为样本,进行实时荧光定量PCR检测特异性研究,并根据4种疟原虫该18S rDNA区域序列不同的特征,对荧光染料标记的PCR产物进行熔解曲线分析,通过比较熔解温度Tm值的差异,鉴别4种人体疟原虫。结果:1实时荧光定量PCR最适反应体系:含有1xPower SYBR Green PCR Master Mix的30μl体系中引物浓度为0.2μM,模板用量为1μl。2实时荧光定量PCR最适反应条件:95℃预变性10min;95℃15s,60℃1min,共45个循环,反应结束后仪器自动进行熔解曲线分析。3实时荧光定量PCR反应敏感性:标准曲线中循环阈值(Ct值)与模板浓度之间具有良好的相关关系(相关系数r=–0.99);最低可以检出在1μl按蚊DNA中含有50个拷贝质粒DNA的样本。4实时荧光定量PCR反应特异性:对4种人体疟原虫18S rDNA重组质粒扩增效果良好,对按蚊及人血DNA均无扩增;4种疟原虫的熔解温度Tm值分别为三日疟71.0℃、恶性疟72.7℃、卵形疟73.9℃、间日疟75.9℃,可通过Tm值分析进行4种人体疟原虫的鉴别。5实验结果重现性:扩增曲线和Tm值在实验内、实验间的重现性良好。结论:本研究所建立的SYBR Green I染料法荧光定量PCR技术具有较高的敏感性和特异性,可同时进行按蚊体内疟原虫子孢子的定量检测和虫种鉴别。II:实时荧光定量PCR检测间日疟原虫子孢子的研究目的:验证新建立的SYBR Green I染料法实时荧光定量PCR技术检测中华按蚊间日疟原虫子孢子的可行性。方法:采集间日疟病人感染血样,采用按蚊体外人工膜饲血系统感染中华按蚊,提取感染后第14～16天按蚊头胸部DNA进行荧光定量PCR检测。结果:1采用新建立的荧光定量PCR技术可特异性扩增中华按蚊子孢子DNA,熔解曲线分析显示扩增产物的Tm值与间日疟原虫重组质粒的Tm值相同,扩增产物测序后经序列比对确认为疟原虫18S rDNA特异性序列;未感染的中华按蚊无DNA特异性扩增。2采用新建立的荧光定量PCR技术、传统子孢子解剖技术和巢式PCR技术检测经实验室人工感染间日疟原虫15天后的中华按蚊样本。荧光定量PCR检测的8只中华按蚊样本中5只阳性,3只阴性,高于采用巢式PCR技术的检测结果,与该批感染按蚊采用传统解剖镜检子孢子的阳性率相似。3感染按蚊DNA经阴性按蚊DNA稀释32倍后仍可检出,提示该方法有较高的检测敏感性,可用于混合样本检测。结论:本研究建立的SYBR Green I染料法实时荧光定量PCR技术可用于媒介按蚊子孢子检测,具有较高的检测敏感性和特异性,且操作简便、快速,进一步优化后有望在现场媒介调查中推广应用。