论文部分内容阅读
目的:1993年,Rosen DR等发现,部分家族性肌萎缩侧索硬化(fALS)的发病与编码铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)的SOD1基因突变有关。该发现为我们提供了一个明确的运动神经元死亡的原因。到目前为止,已确定在20%fALS和4%的散发性肌萎缩侧索硬化(sALS)中有SOD1基因突变,其突变数目已超过100种。其中,93位的甘氨酸(Gly)突变为丙氨酸(Ala)为常见的突变之一。转染了人突变SOD1基因的转基因小鼠具有与ALS病人相同的临床表现,现已成为国际公认的研究ALS的理想模型。在ALS病人及转基因动物模型内均存在蛋白质、脂质和核酸这些生物大分子氧化损伤的证据,提示氧化应激是疾病进程中的一个重要方面,但是机体自身的抗氧化系统是否在疾病的进展过程中起到了保护作用,是否随疾病的进展发挥更高的保护作用,我们不清楚。目前文献报道Nrf2/ARE信号通路的激活可在多种组织中诱导一系列内源性的细胞保护基因上调,其中包括抗氧化酶、抗氧化蛋白、抗炎和解毒的蛋白,它们的活化可以对机体起到保护作用。本试验目的:探讨不同时期B6SJL-TgN(SOD1G93A)1Gur转基因小鼠(携带人突变SOD1基因)与同窝野生型小鼠和B6SJL-TgN(SOD1)2Gur转基因小鼠(携带正常人SOD1基因)相比,脊髓组织中是否存在Nrf2和抗氧化酶HO-1、NQO1表达的差异,了解不同时期机体抗氧化能力的变化情况,也为深入研究转基因小鼠中Nrf2/ARE通路提供前期基础。方法:1、转基因鼠的繁殖所有动物均饲养在恒温(25-27℃)、恒湿和无菌条件的(Specific pathogen free, SPF)环境中,喂以灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料。为维持B6SJL-TgN (SOD1G93A)1 Gur转基因小鼠突变基因稳定下传,将B6SJL SOD1G93A/+半合子雄鼠与B6SJLF1/J半合子雌鼠交配繁殖.子代鼠经基因鉴定确定是否带有人突变的基因2、实验分组研究对象共分为三个时期:症状前期(80天)、症状早期(120天)、终末期。每个时期组除了选择SOD1G93A小鼠及同窝野生型小鼠外,还选取一组同龄hSOD1小鼠作对照,为排除小鼠脊髓中人超氧化物岐化酶表达增多对实验结果的干扰。3、Nrf-2蛋白水平的测定提取脊髓组织的浆蛋白,用Synergy-HT多功能酶标仪测量OD数值,可检测样本蛋白浓度,计算100蛋白上样量。走SDS-PAGE电泳,100V 4度转膜2小时、5%脱脂奶粉封闭1小时;一抗孵育,4oC,过夜;TPBS震荡漂洗5min×5次;荧光二抗孵育,室温,2h;TPBS震荡漂洗5min×5次;Odyssey Infrared Imaging System检测分析。4、HO-1、NQO1基因表达水平的测定取脊髓组织6mg,提取总RNA。用Synergy-HT多功能酶标仪测量OD260/O Odyssey Infrared Imaging System检测分析。D280比值,可检测RNA的纯度和含量,选用OD260/OD280比值为1.8-2.0的RNA用作反转录,合成cDNA。扩增HO-1、NQO1、nrf-2目的基因,在1.5%琼脂糖凝胶(含Goldview染料)上电泳,用GBOX-HR全自动凝胶成像系统拍摄打印实验结果,用凝胶图像分析系统分析结果。结果:与两组对照组相比,转基因小鼠在发病前期脊髓中Nrf-2蛋白水平及抗氧化酶HO-1、NQO1的基因表达无明显变化;症状期、终末期转基因小鼠脊髓中Nrf-2蛋白水平下降及抗氧化酶HO-1、NQO1基因表达明显升高。结论:本实验在肌萎缩侧索硬化转基因小鼠模型的基础上,发现疾病症状早期和终末期存在着Nrf-2激活及下游抗氧化酶基因表达上调的现象。但这些酶的含量很低,对机体的保护作用还需进一步研究。