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第一部分:15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE)介导调节缺氧诱导的SOCC表达增加及CCE增强而收缩肺动脉的机制研究
目的:研究表明,在缺氧过程中,PASMC中内钙离子浓度增加是引起的肺血管收缩的重要原因。本实验室经研究发现了新的血管收缩因子,15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE),可通过诱导细胞内钙库释放引起细胞外容量性钙内流(Capacitative Ca2+entry,CCE),导致PASMC内钙离子浓度增加,引起肺血管收缩。本研究针对缺氧肺动脉高压形成过程中的肺血管收缩这一病理特点,利用阻断剂及RNA干扰技术确定15-HETE参与了缺氧诱导SOCC通道蛋白TRPC家族的活化及表达,肺动脉平滑肌细胞CCE增强的过程的调节,为研究缺氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary arterial hypertension,HPH)的形成,提供新的理论依据。
方法:1.构建缺氧大鼠模型,利用SOCC通道阻断剂SKF96365和La3+,通过血管环实验验证SOCC通道与肺血管收缩的关系;2.通过外源性15-HETE和内源性阻断剂NDGA,检测15-HETE对缺氧培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)CCE的作用;3.通过RT-PCR和Western blot技术确定受缺氧调节的SOCC通道蛋白(TRPC1、4、6)及不同缺氧时间对其表达的影响;4.通过NDGA和15-HETE,观察缺氧过程中PASMC中15-HETE对SOCC通道蛋白表达的影响;5.利用RNAi技术进一步验证缺氧过程中15-HETE对CCE及SOCC通道蛋白表达的影响;6.在组织水平,应用RNAi技术进一步验证缺氧过程中15-HETE与SOCC通道蛋白表达之间的关系。
结果:1.阻断SOCC通道后能明显抑制15-HETE对肺血管的收缩作用;2。外源性15-HETE能够明显增强缺氧诱导的平滑肌细胞的CCE增加过程,通过NDGA阻断内源性15-HETE后能明显抑制缺氧诱导的CCE增强过程;3.缺氧可诱导SOCC通道蛋白TRPC1和6的表达,在缺氧24后TRPC1和6的mRNA水平明显增加,TRPC1蛋白水平也随之显著增加,而在缺氧48h后TRPC6蛋白水平则出现显著增加;4.在缺氧培养的过程中,外源性15-HETE可增强TRPC1蛋白的表达,阻断内源性15-HETE则部分抑制缺氧诱导的TRPC1表达增加,而在这两个过程中,TRPC6蛋白的表达无明显变化;5.利用RNAi技术干扰内源性15-LO表达后,15-HETE水平也特异性降低,缺氧诱导的CCE增强和TRPC1表达增加也受到明显抑制;6.组织水平,干扰肺血管内源性15-LO/15-HETE,缺氧培养48h后,缺氧对TRPC1表达的诱导作用也明显受到抑制。
结论:在缺氧过程中,15-HETE通过诱导TRPC1蛋白表达,增强平滑肌细胞的CCE,引起细胞内钙浓度增加,进而参与调控缺氧引起的肺血管收缩过程,是参与调控HPH的形成的机制之一。
第二部分:miR-138在缺氧肺动脉高压形成中的作用及机制研究
目的:近年来的研究显示,miRNA在多种人类的疾病的发展中发挥重要的调节作用,对细胞的凋亡、增殖有重要的调控作用。本研究针对缺氧肺动脉高压形成过程中的肺血管增殖这一病理过程,设计并研究miRNA在HPVR过程中的作用及其机制,为临床中预防和治疗肺动脉高压提供新的理论依据和治疗靶点。
方法:1.制备缺氧大鼠模型,记录血压变化,分离肺组织及肺动脉血管组织,HE染色鉴定;2.采用基因芯片技术及qRT-PCR技术筛选缺氧过程中表达发生变化的microRNA,原位杂交鉴定组织分布;3.采用原代培养的肺主动脉平滑肌细胞,应用MTT技术检测细胞活力,确定miR-138对细胞凋亡的影响;4.预测miR-138的作用靶点,采用荧光素酶双报告基因技术检测miR-138与Mst1的靶向调节作用;5.利用体外转染技术,进一步验证miR-138对Mst1蛋白的影响;6.利用细胞凋亡模型,采用形态学实验及Western Blot技术,进一步验证miR-138对平滑肌细胞凋亡的影响;7.利用细胞凋亡模型,验证缺氧条件下miR-138对细胞凋亡的影响;8.利用AKT阻断剂和体外转染技术确定miR-138调节Mst1表达保护肺动脉平滑肌细胞凋亡的机制。
结果:1.大鼠模型缺氧9天后,肺动脉压升高,肺血管收缩力增加,HE染色表明肺小动脉血管出现中层肥厚及炎细胞浸润现象;2.基因芯片筛查结果,缺氧大鼠肺血管中11个microRNA表达变化2倍以上,其中3个mir的表达下调、8个mir表达上调;3.缺氧大鼠肺血管组织及缺氧培养的肺动脉平滑肌细胞中,miR-138表达明显增加,Mst1蛋白表达量明显降低;4.miR-138能显著抑制靶基因Mst1的表达,并对其mRNA水平无明显影响;5.在SD诱导的肺动脉平滑肌细胞凋亡模型中,miR-138可以减轻细胞凋亡的程度,对细胞的凋亡过程有保护作用;6.在缺氧条件下,miR-138对细胞的凋亡过程仍有保护作用;7。miR-138通过抑制Mst1表达激活AKT,从而保护平滑肌细胞凋亡过程。
结论:miR-138参与了缺氧肺动脉高压形成的过程,其机制是通过抑制Mst1蛋白的表达,激活AKT,进而参与调节肺动脉平滑肌细胞凋亡的过程,通过保护细胞的凋亡过程,进而引起肺血管重构,是HPH发生的可能机制。