第一部分：15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE)介导调节缺氧诱导的SOCC表达增加及CCE增强而收缩肺动脉的机制研究　　 目的：研究表明，在缺氧过程中，PASMC中内钙离子浓度增加是引起的肺血管收缩的重要原因。本实验室经研究发现了新的血管收缩因子，15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE)，可通过诱导细胞内钙库释放引起细胞外容量性钙内流(Capacitative Ca2+entry，CCE)，导致PASMC内钙离子浓度增加，引起肺血管收缩。本研究针对缺氧肺动脉高压形成过程中的肺血管收缩这一病理特点，利用阻断剂及RNA干扰技术确定15-HETE参与了缺氧诱导SOCC通道蛋白TRPC家族的活化及表达，肺动脉平滑肌细胞CCE增强的过程的调节，为研究缺氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPH)的形成，提供新的理论依据。　　 方法：1.构建缺氧大鼠模型，利用SOCC通道阻断剂SKF96365和La3+，通过血管环实验验证SOCC通道与肺血管收缩的关系；2.通过外源性15-HETE和内源性阻断剂NDGA，检测15-HETE对缺氧培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)CCE的作用；3.通过RT-PCR和Western blot技术确定受缺氧调节的SOCC通道蛋白(TRPC1、4、6)及不同缺氧时间对其表达的影响；4.通过NDGA和15-HETE，观察缺氧过程中PASMC中15-HETE对SOCC通道蛋白表达的影响；5.利用RNAi技术进一步验证缺氧过程中15-HETE对CCE及SOCC通道蛋白表达的影响；6.在组织水平，应用RNAi技术进一步验证缺氧过程中15-HETE与SOCC通道蛋白表达之间的关系。　　 结果：1.阻断SOCC通道后能明显抑制15-HETE对肺血管的收缩作用；2。外源性15-HETE能够明显增强缺氧诱导的平滑肌细胞的CCE增加过程，通过NDGA阻断内源性15-HETE后能明显抑制缺氧诱导的CCE增强过程；3.缺氧可诱导SOCC通道蛋白TRPC1和6的表达，在缺氧24后TRPC1和6的mRNA水平明显增加，TRPC1蛋白水平也随之显著增加，而在缺氧48h后TRPC6蛋白水平则出现显著增加；4.在缺氧培养的过程中，外源性15-HETE可增强TRPC1蛋白的表达，阻断内源性15-HETE则部分抑制缺氧诱导的TRPC1表达增加，而在这两个过程中，TRPC6蛋白的表达无明显变化；5.利用RNAi技术干扰内源性15-LO表达后，15-HETE水平也特异性降低，缺氧诱导的CCE增强和TRPC1表达增加也受到明显抑制；6.组织水平，干扰肺血管内源性15-LO/15-HETE，缺氧培养48h后，缺氧对TRPC1表达的诱导作用也明显受到抑制。　　 结论：在缺氧过程中，15-HETE通过诱导TRPC1蛋白表达，增强平滑肌细胞的CCE，引起细胞内钙浓度增加，进而参与调控缺氧引起的肺血管收缩过程，是参与调控HPH的形成的机制之一。　　 第二部分：miR-138在缺氧肺动脉高压形成中的作用及机制研究　　 目的：近年来的研究显示，miRNA在多种人类的疾病的发展中发挥重要的调节作用，对细胞的凋亡、增殖有重要的调控作用。本研究针对缺氧肺动脉高压形成过程中的肺血管增殖这一病理过程，设计并研究miRNA在HPVR过程中的作用及其机制，为临床中预防和治疗肺动脉高压提供新的理论依据和治疗靶点。　　 方法：1.制备缺氧大鼠模型，记录血压变化，分离肺组织及肺动脉血管组织，HE染色鉴定；2.采用基因芯片技术及qRT-PCR技术筛选缺氧过程中表达发生变化的microRNA，原位杂交鉴定组织分布；3.采用原代培养的肺主动脉平滑肌细胞，应用MTT技术检测细胞活力，确定miR-138对细胞凋亡的影响；4.预测miR-138的作用靶点，采用荧光素酶双报告基因技术检测miR-138与Mst1的靶向调节作用；5.利用体外转染技术，进一步验证miR-138对Mst1蛋白的影响；6.利用细胞凋亡模型，采用形态学实验及Western Blot技术，进一步验证miR-138对平滑肌细胞凋亡的影响；7.利用细胞凋亡模型，验证缺氧条件下miR-138对细胞凋亡的影响；8.利用AKT阻断剂和体外转染技术确定miR-138调节Mst1表达保护肺动脉平滑肌细胞凋亡的机制。　　 结果：1.大鼠模型缺氧9天后，肺动脉压升高，肺血管收缩力增加，HE染色表明肺小动脉血管出现中层肥厚及炎细胞浸润现象；2.基因芯片筛查结果，缺氧大鼠肺血管中11个microRNA表达变化2倍以上，其中3个mir的表达下调、8个mir表达上调；3.缺氧大鼠肺血管组织及缺氧培养的肺动脉平滑肌细胞中，miR-138表达明显增加，Mst1蛋白表达量明显降低；4.miR-138能显著抑制靶基因Mst1的表达，并对其mRNA水平无明显影响；5.在SD诱导的肺动脉平滑肌细胞凋亡模型中，miR-138可以减轻细胞凋亡的程度，对细胞的凋亡过程有保护作用；6.在缺氧条件下，miR-138对细胞的凋亡过程仍有保护作用；7。miR-138通过抑制Mst1表达激活AKT，从而保护平滑肌细胞凋亡过程。　　 结论：miR-138参与了缺氧肺动脉高压形成的过程，其机制是通过抑制Mst1蛋白的表达，激活AKT，进而参与调节肺动脉平滑肌细胞凋亡的过程，通过保护细胞的凋亡过程，进而引起肺血管重构，是HPH发生的可能机制。