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目的:神经轴突再生是神经损伤后功能恢复的基础,然而在临床上神经轴突再生特别是中枢神经系统(Central nervous system,CNS)轴突的再生依然是一个难以解决的问题。神经元轴突的完整性在神经元之间物质运输及信号传递起着非常重要的作用。轴突再生能力的强弱取决于神经元所处的环境以及自身的再生能力。Kruppel样因子4(Kruppel-like factor4,KLF4)是锌指蛋白转录因子家族的成员。研究发现敲除Klf4基因可以促进视网膜神经节细胞(Retinal ganlion cells,RGCs)的轴突再生,但是敲除Klf4基因对皮质脊髓束(Corticospinal tract,CST)和坐骨神经再生的影响未知。因此,本课题拟通过脊髓夹伤模型、坐骨神经夹伤模型及体外神经元培养等方法研究敲除Klf4对哺乳动物轴突再生的影响。方法:1.为了构建背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)感觉神经元内Klf4特异性敲除小鼠,我们用Klf4 floxed(Klf4f/f)小鼠分别与Advillin-Cre(Avil-Cre)小鼠和Pirt-Cre小鼠交配,所生子代再与Klf4f/f小鼠交配,最终获得Klf4f/f/Avil-Cre小鼠和Klf4f/f/Pirt-Cre小鼠,分别使用染色和蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)检测Klf4敲除后蛋白表达变化情况。2.成年ICR(Institute of Cancer Research)小鼠接受了坐骨神经切断术(axotomy),WB用于检测axotomy后1、3、7、21天KLF4蛋白表达的变化,然后对axotomy后7天的DRG组织切片进行免疫荧光染色检测KLF4蛋白的变化。3.体外取Klf4f/f/Avil-Cre、Klf4f/f/Pirt-Cre及Klf4f/f小鼠的DRG感觉神经元培养3天。用神经元特异性抗体免疫荧光染色测定并统计轴突长度。4.对Klf4f/f/Avil-Cre、Klf4f/f/Pirt-Cre及Klf4f/f小鼠的DRG进行体内电穿孔转染EGFP(Enhanced green fluorescent protein)质粒以标记感觉神经元轴突,2天后夹伤坐骨神经,再3天取坐骨神经压片,测量再生轴突长度。5.对Klf4f/f小鼠大脑皮层注射AAV-Cre病毒以敲除皮层Klf4基因,对照组注射AAV-GFP病毒。2周后进行T8脊髓夹伤,再过6周在大脑皮层注射生物素葡聚糖胺(Biotin dextran amine,BDA)以标记CST,再2周处死小鼠取脊髓进行冰冻切片。对切片进行CyTM3染色以标记CST,统计再生轴突情况。结果:1.与Klf4f/f小鼠相比,Klf4f/f/Avil-Cre小鼠和Klf4f/f/Pirt-Cre小鼠DRG切片的免疫荧光染色显示DRG感觉神经元核内KLF4表达减少。WB显示Klf4f/f/Avil-Cre小鼠和Klf4f/f/Pirt-Cre小鼠DRG中的KLF4蛋白表达量明显降低(P<0.01)。上述结果表明KLF4在DRG感觉神经元中被特异性敲除,我们成功构建出所需实验小鼠。2.对ICR小鼠行axotomy后,WB显示KLF4的表达量降低,其中第7天降到最低(P<0.01),第21天较第7天略有增加。axotomy后第7天的DRG组织冰冻切片免疫荧光染色显示,核内KLF4蛋白表达降低,提示KLF4可能和感觉神经元轴突再生有关。3.DRG感觉神经元的体外培养实验显示Klf4f/f/Avil-Cre小鼠(P<0.01)和Klf4f/f/Pirt-Cre小鼠(P<0.001)再生的轴突长度比Klf4f/f小鼠长。4.敲除Klf4能促进坐骨神经损伤后的再生(P<0.001)。5.在大脑皮层敲除Klf4基因,能促进脊髓损伤后CST的再生(P<0.05)。结论:敲除Klf4基因能促进哺乳动物轴突的再生。