吗啡，是临床常用的一种阿片类镇痛药物，被广泛用于治疗多种如癌症、神经损伤等所导致的慢性疼痛。然而，病人长期应用吗啡却可以导致对吗啡镇痛作用的耐受，表现为吗啡镇痛效应下降、镇痛作用时间缩短、痛觉过敏及停用吗啡后疼痛增强。因此使得长期使用吗啡受到了限制。 由于吗啡是通过与中枢神经系统以及外周神经系统的神经元上的mu阿片受体(μopioidreceptor,MOR)结合而发挥其镇痛作用，因此以往对吗啡耐受机制的研究主要是针对神经元，认为吗啡耐受的机制是与参与痛觉传递的神经元对吗啡产生了适应性有关，如：MOR与G蛋白的失偶联、受体内化或下调、NMDA受体数量或功能的上调、神经元谷氨酸转运体下调、细胞内分子如蛋白激酶A(proteinkinaseA，PKA)、蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)、钙调素Ⅱ(CaMulinⅡ,CaMⅡ)的表达或功能增强；另外，神经递质如兴奋性氨基酸(excitatoryaminoacid，EAA)、P物质(substanceP,SP)、钙基因相关肽(calciumgene-relatedpeptide，CGRP)、一氧化氮(nitricoxide，NO)和前列腺素(prostaglandins，PGs)等产生增多，从而导致感觉传递神经元的敏感化而拮抗吗啡的镇痛作用。近几十年来虽然对吗啡耐受的机制进行了大量的研究，然而关于耐受产生的机制目前仍不清楚。 近年来，神经系统内的非神经细胞(non-neuronalcells)，胶质细胞(glia)在吗啡耐受机制中的作用引起了人们的重视。虽然传统观点认为胶质细胞，包括小胶质细胞(microglia)和星型胶质细胞(astrocyte)对神经元起了保护、营养和支持等作用。但最近的研究表明胶质细胞在吗啡耐受中发挥了重要作用。Song和zhao首次发现在吗啡耐受的动物其神经胶质细胞被激活，胶质细胞纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)表达上调，而且胶质细胞的抑制剂可以明显抑制吗啡耐受的形成，提示胶质细胞参与了吗啡耐受。而Johnston等人也证实脊髓小胶质细胞参与了吗啡耐受。进一步的研究表明，脊髓胶质细胞参与吗啡耐受是通过其释放的细胞因子而实现的，如肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-alpha,TNF-α)，白细胞介素-1-belta(interlukin-1β，IL-β)和白细胞介素-6(interlukin-6)等。然而，关于胶质细胞参与吗啡耐受的分子调节机制目前还不清楚。 p38MAPK(mitogen-activatedproteinkinases)是丝裂霉素蛋白激酶家族的成员，可以被各种应激刺激而激活，从而调节细胞的分化和增殖。另外，在炎性细胞p38MAPK还参与调节细胞因子的产生。最近有研究表明，脊髓小胶质细胞p38的激活参与了神经病理性疼痛的形成，抑制p-p38的功能或阻断p38的磷酸化都可以显著的抑制疼痛的产生。 米诺环素(minocycline)是第二代半合成四环素类抗生素，目前研究发现其具有特异性地抑制小胶质细胞激活和增殖的生物学效应。近年来的研究表明米诺环素通过抑制小胶质细胞而在多种神经病理性疾病中，如脑缺血、帕金森氏病、亨庭顿氏病以及脊髓损伤等发挥着神经保护作用。最近研究发现米诺环素还可以有效地减轻炎性和神经损伤性病理性疼痛。 由于神经病理性疼痛和吗啡耐受在发生上有许多共同的产生机制，因此本研究推断p38MAPK可能也参与吗啡耐受的形成，并发挥重要的作用。为阐明上述问题，本实验拟进行两方面的研究：(1)在吗啡耐受动物模型中观察脊髓胶质细胞p38激活的动态改变，并探讨脊髓胶质细胞p38在吗啡耐受中的作用；(2)探讨米诺环素对吗啡耐受的作用及其作用机制。本研究有助于进一步揭示吗啡耐受机制，特别是胶质细胞p38在吗啡耐受机制中的作用，并为研制开发新型的阿片类镇痛药提供理论依据。 第一章脊髓小胶质细胞p38MAPK在吗啡耐受中的表达和作用本研究通过对SD大鼠连续7天鞘内注射吗啡15μg建立吗啡耐受的动物模型，用50℃热水甩尾法观察吗啡的镇痛效果，并用免疫组织化学观察脊髓p-p38的表达。结果表明，慢性鞘内注射吗啡7天后，吗啡镇痛作用明显下降，表明吗啡耐受的形成。免疫组织化学染色显示脊髓p-p38MAPK表达明显上调。免疫荧光双染表明p38的激活只存在于脊髓小胶质细胞，而不存在于星型胶质细胞和神经元。为研究p38在吗啡耐受中的作用，本文在每次吗啡注射前30分钟先鞘内给予p38抑制剂SB203580(10μg或2μg)，连续注射7天。结果表明SB203580(10μg或2μg)预处理均可以明显抑制吗啡镇痛耐受的形成，提示吗啡耐受时可诱导脊髓小胶质细胞p38磷酸化水平增加，p38可能介导吗啡耐受。 为进一步研究抑制p38能否逆转已形成的耐受，本研究在第8天(已形成明显吗啡耐受)注射吗啡前30分钟鞘内注射给予10μgSB203580，证实10μgSB203580并不能恢复吗啡的镇痛作用。另外，还观察了SB203580对小胶质细胞和星型胶质细胞激活的影响。结果表明，用SB203580持续抑制p38不能抑制慢性吗啡注射所诱导的脊髓小胶质细胞的激活及OX-42表达的上调；然而，抑制小胶质细胞p38却能够明显的抑制星型胶质细胞的激活和GFAP表达的上调，提示小胶质细胞在吗啡耐受形成过程中，可通过p38激活进而激活星型胶质细胞。。 第二章鞘内注射米诺环素对吗啡耐受的作用 为了进一步探讨脊髓小胶质细胞及其p38激活在吗啡耐受中的作用，本实验中观察小胶质细胞的特异性抑制剂米诺环素对吗啡耐受的作用。于注射吗啡前30分钟鞘内注射米诺环素(100μg、50μg或20μg)，每天一次，连续注射7天。结果表明，米诺环素100μg本身不影响大鼠的基础痛阈，但可以显著抑制吗啡耐受的形成，并且其抑制作用呈剂量依赖关系。为观察米诺环素能否拮抗已形成的吗啡耐受，本文于吗啡耐受诱导后第4天开始给予米诺环素50μg，30分钟后注射吗啡，连续注射4天。结果表明，在耐受早期，米诺环素仍可以抑制其进一步形成，与吗啡耐受组相比，于注射吗啡第7天，在米诺环素加吗啡组，吗啡仍可以产生明显的镇痛作用(图2-3)。为了进一步观察米诺环素是否可以逆转已经形成的吗啡耐受，我们于鞘内注射吗啡的第8天开始注射米诺环素，连续注射4天，结果发现米诺环素不能使吗啡恢复镇痛作用(图2-4)。 为了进一步探讨米诺环素抑制吗啡耐受的机制，本文用免疫组织化学方法检测米诺环素对小胶质细胞p-p38表达的影响。研究表明，持续7天鞘内注射米诺环素可以显著抑制吗啡耐受过程中脊髓小胶质细胞p-p38表达的上调(图2-5)，提示米诺环素可通过抑制脊髓小胶质细胞p38的激活而发挥其抗吗啡耐受作用；而且即使耐受形成后第8天开始注射米诺环素仍然能够抑制p-p38的上调。另外，米诺环素无论在吗啡耐受过程中还是吗啡耐受诱导后都可以抑制小胶质细胞的激活和OX-42的表达。值得注意的是，米诺环素还可以在吗啡耐受诱导的过程中抑制星型胶质细胞的激活和GFAP表达的上调；但在耐受形成之后星型胶质细胞的激活和GFAP则不受影响，提示在吗啡耐受过程中，米诺环素可通过抑制小胶质细胞p38的激活进而抑制星型胶质细胞的激活而发挥抗吗啡耐受作用，但一旦吗啡耐受形成后，星型胶质细胞的激活则不受小胶质细胞的作用，这可能是米诺环素不能逆转吗啡耐受的机制之一。 结论1.鞘内慢性注射吗啡可激活脊髓小胶质细胞，使其p38磷酸化水平增加； 2.p38抑制剂SB203580能部分地显著地抑制吗啡耐受，提示脊髓小胶质细胞p38激活可能是吗啡耐受的机制之一； 3.四环素类抗生素米诺环素不仅可以显著地抑制吗啡耐受形成，而且可以部分地拮抗已形成的早期吗啡耐受； 4.米诺环素能显著地抑制脊髓小胶质细胞p38表达，这可能是其抗吗啡耐受的机制之一； 5.脊髓小胶质细胞p38激活介导了吗啡耐受中星型胶质细胞的激活。 本研究为深入阐明脊髓胶质细胞在吗啡耐受中的作用提供了新颖的实验资料，并为应用米诺环素抗吗啡耐受提供了新思路。