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【背景】慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease,CKD)具有很高的发病率,目前全世界的患病率已达8–16%,严重危害病人健康、加重家庭和社会的经济负担。临床上治疗此种疾病的药物有:利尿药、糖皮质激素药、抗高血压药和免疫抑制药,但这些药物存在副作用大,不良反应多等缺点。中药治疗CKD具有悠久的历史,目前临床上使用较多的中药有肾康注射液(Shenkang injection,SKI)、肾康丸和黄芪当归合剂。但因为这些中药复方制剂药效物质不清,作用机制不明,很难得到大众的认可。本研究中,我们选用SKI为研究对象,首先采用大鼠和细胞模型确定SKI的药效和机制,然后根据已检测出的SKI的所有活性成分,运用体内和体外模型筛选其活性成分中抗氧化和抗纤维化最有效的成分,从而揭示其药效物质,并探索药效物质治疗慢性肾脏疾病的分子机制。【目的】1.确定SKI的药效,同时探讨其抗纤维化和抗氧化应激的机制。2.运用大鼠肝微粒体脂质过氧化物模型和HK-2细胞模型,探讨SKI中10个中药单体:大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚、没食子酸、原儿茶醛、丹参素以及毛蕊异黄酮抗氧化和抗纤维化的效果,筛选治疗CKD潜在的药物。3.应用5/6Nx大鼠模型和HK-2细胞考察大黄酸治疗CKD的药效和作用机制。【方法】1.通过5/6肾切除(5/6Nx)建立大鼠慢性肾损伤模型。检测血中肌酐和尿素氮,观察组织形态学的变化。检测肾组织中肾纤维化相关指标纤连蛋白(FN)、胶原Ι、α-肌动蛋白(α-SMA)、转录生长因子-β(TGF-β)和p-Smad3的表达。同时考察肾小管上皮细胞(HK-2)中TGF-β/Smad3通路对肾纤维化和氧化应激的影响。2.通过检测SKI中这10种中药单体抑制大鼠肝微粒体脂质过氧化物、清除自由基的能力,以及对HK-2细胞中氧化损伤指标:活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSG)的影响,考察其抗氧化的能力。通过检测HK-2细胞中TGF-β和结缔组织生长因子(CTGF)蛋白的表达考察其抗纤维化的能力。3.采用HE、MASSON、TUNEL染色和电镜观察5/6Nx肾组织病理结构、间质纤维化、细胞凋亡和超微结构的变化,同时用免疫印迹法测量大鼠肾组织纤维化和氧化应激相关指标的变化。建立SIRT3基因沉默的HK-2细胞模型,检测FOXO3α蛋白;氧化应激相关指标:ROS、8-羟化脱氧鸟苷(8-OHd G)、p47phox和gp91phox;纤维化相关指标:α-SMA、钙粘蛋白(E-cadherin)和TGF-β;以及凋亡相关指标的表达。【结果】1.5/6Nx大鼠经SKI和依那普利处理后可以降低血中肌酐和尿素氮,改善肾组织形态学的变化,降低TGF-β/Smad3信号通路和肾组织纤维化相关指标的表达,如FN、collageΙ和α-SMA。在HK-2细胞中,经TGF-β和H2O2刺激后,纤维化和氧化应激相关指标增加,SKI处理后,能够通过抑制TGF-β和p-Smad3的表达减轻细胞的纤维化和氧化损伤。2.大黄酸、大黄素、没食子酸、迷迭香酸、原儿茶醛和丹参素这几种单体具有抑制脂质过氧化物和清除自由基的能力,其中大黄酸、大黄素和迷迭香酸减轻HK-2细胞氧化损伤和纤维化的能力比其它7种成分强,同时还能增加HK-2细胞的存活力,降低乳酸脱氢酶(LDH)的释放。3.大黄酸可以改善肾组织形态和超微结构的变化,减少肾细胞凋亡,减轻肾间质纤维化和氧化损伤。通过激活SIRT3/FOXO3α信号通路,大黄酸可以改善细胞氧化应激和纤维化,但不能减少细胞凋亡。【结论】1.SKI通过下调TGF-β/Smad3信号通路抑制肾的纤维化和氧化损伤。2.大黄酸、大黄素和迷迭香酸具有很强的抗氧化和抗纤维化的作用,能够成为治疗CKD重要的候选药物。3.大黄酸通过抗氧化、抗纤维化和抗凋亡保护5/6Nx大鼠的肾损伤,其抗氧化和抗纤维化的作用与激活SIRT3/FOXO3α信号通路有关。