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目的：⑴分离培养并鉴定人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，建立原代人血管内皮细胞培养技术，为后续研究提供目的细胞。⑵探讨用不同分子量HA诱导HUVEC后细胞的增殖能力变化和细胞连接蛋白Ezrin、Merlin的表达状况。⑶建立原代HUVEC的RNA干扰(RNAi)技术，干扰目的基因Ezrin和Merlin的mRNA表达。⑷探讨HUVEC Ezrin和Merlin基因沉默后，HA诱导细胞中Ezrin和Merlin表达与HA分子量的相关性。
方法：①分离人脐静脉内皮细胞：取本院剖腹产新生婴儿脐带(约15-25cm)，生理盐水灌注冲洗静脉腔后，加入I型胶原酶消化分离人脐静脉内皮细胞，内皮专用培养基EGM-2培养传代。②免疫荧光检测HUVEC细胞中Ezrin和Merlin的表达及分布。③分别合成三对针对Ezrin和Merlin基因的小干扰RNA，电穿孔法将各三对Ezrin和Merlin的siRNA导入HUVEC，接种于六孔板，EGM-2培养基正常培养，筛选最适合干扰的一对siRNA片段。④用选定Ezrin siRNA片段干扰HUVEC，RT-PCR与Western-blot证明干扰效率。
结果：⑴原代培养细胞培养10-15左右天长成单层，细胞呈多角形，铺路石样排列。⑵免疫荧光证实HUVEC高表达Ezrin和Merlin。2.200μ g/ml nHA抑制HUVEC增殖，而10μg/mloHA促进HUVEC增殖。3.200μ g/ml nHA诱导HUVEC后Ezrin和Merlin mRNA表达没有显著差异，10μ g/ml oHA诱导HUVEC后EzrinmRNA水平在24h显著升高，Merlin mRNA及蛋白表达与对照相比无显著性差异。⑶电穿孔法成功干扰原代HUVEC，细胞存活率达70—80％以上。建立电击干扰原代HUVEC细胞模型；siRNA干扰后Ezrin和Merlin基因的mRNA的表达水平分别降低达80-90％，干扰效率较好。⑷RT-PCR与Western-blot证明Ezrin siRNA干扰HUVEC成功，符合实验要求；oHA诱导siEzrin HUVEC细胞增殖能力未发生显著性改变，nHA诱导siEzrin HUVEC细胞增殖能力降低。
结论：①通过酶灌注法消化脐静脉血管获得细胞，操作简便、高效，EGM-2培养基可保证内皮细胞具有较高纯度，细胞形态学观察和细胞生物学鉴定证明获得人脐静脉血管内皮细胞。②不同分子量HA对血管内皮细胞具有不同的增殖效应，高分子量HA抑制细胞增殖，低分子量HA促进细胞增殖；低分子量HA片段具有较为明确的促增殖效应，且与蛋白Ezrin表达具有相关性，而高分子量HA抑制增殖效应与Merlin的相关性尚未明确。③siRNA成功干扰人脐静脉内皮细胞Ezrin和Merlin的表达，电穿孔法干扰原代培养细胞具有较好干扰效果，操作简便，干扰效率高；干扰后Ezrin和Merlin基因的基因和蛋白表达水平显著降低。④通过阻断Ezrin分子在血管内皮细胞中的表达，发现在Ezrin在失活或低表达状态Merlin蛋白结构会发生变化，由失活变为活化状态，发挥抑制细胞增殖的作用。从另一面证明了在Ezrin分子高表达时，Merlin蛋白处于失活状况。综合第二部分结果，提示HA确实可以通过HA-CD44-埃兹蛋白亚家族途径影响内皮细胞增殖能，nHA可能通过nHA-CD44-Merlin途径抑制细胞增殖。oHA可能通过oHA-CD44-Ezrin途径促进细胞增殖。