1.两种兔骨性关节炎动物模型的比较[目的]探讨建立两种骨性关节炎动物模型的效果及其适用条件。[方法] 17只新西兰大白兔分为Hulth模型组、韧带切除模型组及空白对照组。在手术建模后第1w、3w、6w取双侧股骨髁部,比较各组骨关节大体形态及病理变化。[结果]两模型组Mankin’s评分显著高于对照组( P < 0. 05),关节软骨退变进行性加重。Hulth模型组关节炎程度较严重,类似骨性关节炎中晚期,韧带切除模型组类似骨性关节炎早期或中期。[结论] Hulth模型组和韧带切除模型组均能建立标准的骨性关节炎动物模型。Hulth模型组适用于外科手术治疗方面研究,韧带切除模型适合发病机理、药物治疗方面研究。2一种新的兔骨性关节炎动物模型的建立[目的]探讨建立新型骨性关节炎动物模型的方法,以适应软骨组织工程技术修复骨性关节炎软骨缺损研究的要求。[方法] 22只新西兰大白兔分为改良组、对照组进行手术建模,术后第3w、6w行双侧股骨髁部和髌沟部取材,比较两种骨性关节炎动物模型的大体形态及病理变化。[结果]改良组股骨髌沟部Mankin’s评分显著高于对照组( P < 0.01),两组股骨髁部Mankin’s评分无显著差别( P > 0.05),关节软骨退变进行性加重。[结论]改良组和对照组均能获得满意的骨性关节炎动物模型,改良组为应用软骨组织工程技术研究骨性关节炎软骨缺损修复提供了一种新的动物模型。3.BMSCs的分离培养和透明质酸钠-细胞微球三维诱导[目的]探讨兔骨髓间充质干细胞体外分离培养和透明质酸钠-细胞球团三维诱导向软骨细胞定向分化的条件,实现诱导支架和体内植入支架分离,达到运用可注射化软骨组织工程技术微创治疗软骨缺损目的。[方法]采用全骨髓血培养法从健康兔骨髓组织中分离纯化并扩增至第二代骨髓间充质干细胞,对所获得的细胞进行体外培养和表面标志的流式细胞仪分析。BMSCs经离心浓缩加入一定数量的透明质酸盐(hyaluronic acid,HA),形成三维高浓度细胞微球,经诱导液处理7～14d。对细胞球团进行HE染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色,流式细胞仪鉴定诱导后细胞的软骨细胞表型。[结果]培养的骨髓间充质干细胞均一表达CD29、CD44,而CD34、CD45和HLA-DR呈阴性。细胞经过诱导液作用14d后, HE染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色显示有软骨细胞形成及软骨基质分泌,立体细胞球团诱导对细胞周期影响不大,细胞状态良好,凋亡现象不明显,各组细胞未见异倍体细胞形成。[结论]采用全骨髓血培养法能分离培养获得高纯度的骨髓间充质干细胞。该细胞经离心浓缩可形成高浓度细胞团,在诱导液作用下可定向分化为软骨细胞。该三维细胞微球在诱导后可再消化,收获游离的已分化软骨细胞,实现了诱导支架和体内植入支架的分离。4. BMSCs在新型三维支架中向软骨细胞方向体外立体诱导分化[目的]研究构建纤维蛋白胶(fibrin glue, FG)-透明质酸钠新型三维支架的方法及其在体外与骨髓间充质干细胞(Bone marrow derivedmesenchymal stem cell,BMSC)构成三维复合体的方法,评价其诱导生成软骨细胞及合成软骨基质的效果,为进一步动物体内实验和过渡到临床应用提供实验基础。[方法]培养第三代(P3)兔BMSCs,与HA、PG、氨甲苯酸(aminomethylbenzoic, AM)通过共推针具和自制的模具混合制成含有较高密度BMSCs的三维细胞支架复合体,经诱导液诱导向软骨方向分化,观察不同时间段BMSCs的生长情况、支架降解情况、复合体质量变化;通过组织切片染色观察软骨细胞及软骨基质合成情况;通过扫描电镜(scanning electron microscope SEM)观察支架孔隙大小形状及交通孔,观察支架细胞复合情况;通过流式细胞仪检测,了解材料对BMSCs的细胞周期、DNA含量及倍体水平的影响,并计算样品细胞的DNA指数(DNA index, DI)。[结果] BMSC生长情况良好,支架降解较对照组显著减慢,2组间每个时间段剩余支架重量有显著性差异(P<0.001)。扫描电镜显示支架孔隙率高,支架内BMSCs密度大。流式细胞仪检测未发现异倍体细胞,对MSC细胞周期的分析结果表明两种材料对细胞周期亦无影响,细胞成活好。[结论]新型3D支架可作为移植BMSCs的临时支架至少4w以上,基本满足软骨生长的需要,并可明显促进BMSC的繁殖?表型的维持?基质的分泌,在支架系统中加入外源性HA后对BMSC向软骨分化有着更好的作用。5.骨性关节炎动物模型关节内软骨修复实验[目的]进一步验证新型支架复合向软骨诱导的自体BMSC后在活体关节内软骨生成能力,研究在严重骨性关节炎(osteoarthritis, OA)环境下利用新型支架复合向软骨诱导的自体BMSC修复陈旧性软骨缺损的可行性及效果,比较不同外科手段治疗骨性关节炎的效果,为进一步指导临床积累理论依据。[方法]新西兰大白兔OA模型42只,随机分3组:CFH组、D组和FH组,抽取14只CFH组兔骨髓,分离培养出自体BMSCs,向软骨细胞方向诱导10～14d,同HA、PG和AM混合制作可注射的细胞三维支架复合物,利用共推针具注入14只CFH组兔膝关节股骨髌沟部软骨缺损处,填充物细胞终浓度达2×106个/ml;在D组,软骨缺损内用直径0.5mm的克氏针作7～10个深达髓腔的钻孔减压治疗;在FH组,不含自体BMSCs的生物蛋白胶A液、B液通过共推针立即被注入软骨缺损处;每组在术后第6w、12w、24w3个时段处死获取兔膝关节股骨髌沟部标本进行组织学评分及统计分析。[结果]随着时间推移,参与实验的42只兔(84膝)股骨髌沟部骨性关节炎程度日益加重,尤以24w最明显,共30只膝关节中有19只股骨髌沟部软骨包括新生软骨存在明显退变。12w和24w时,CFH组软骨缺损区完全为新生组织所充填,表面平滑,与周围组织结合紧密;D组缺损内新生组织未完全填满缺损,表面欠平整;FH组缺损明显。对组织学评分进行统计分析表明:3组间各时间段均有显著性差异(p<0.001),CFH组6w评分同12w和24w评分相比有显著性差异(p=0.023和0.043), 12w和24w评分差异无统计学意义(p=0.769)。[结论]新型可注射支架复合ABMSC能够很好修复严重骨性关节炎所致的陈旧软骨缺损并能明显延缓骨性关节炎的进展。