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创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)一直是威胁人类健康的重要问题。脑外伤不仅导致脑皮质的原发损伤,也会引起继发性海马神经细胞的死亡,造成了脑外伤后癫痫发作、记忆及学习障碍等。迄今为止,颅脑外伤的治疗尚缺乏确切有效的药物。因此,如何进一步探究TBI的发病机制和病理生理过程,以寻求更加确切有效的治疗方法成为国内外学者关注的焦点问题。颅脑外伤后遭受原发打击的神经细胞快速大量释放以谷氨酸为主的多种兴奋性神经递质,对未受直接打击的神经细胞产生兴奋性毒性,是导致脑外伤后继发性损伤的重要病理生理机制。然而,应用外源性药物治疗颅脑外伤却收效甚微,在此情况下,如何启动和开发内源性脑保护机制成为了研究热点。大量基础研究表明,突触前膜释放谷氨酸的同时,可主动释放一种保护性肽类神经递质N-乙酰天冬氨酰谷氨酸(NAAG),它能够负反馈抑制突触前膜上的谷氨酸进一步释放。可惜的是,突触间隙内的NAAG在释放后很快被胶质细胞表面的NAAG肽酶水解成N-乙酰天冬氨酸(N-acetylaspartate,NAA)及谷氨酸,失去其内源性保护作用。研究证明NAAG主要由GCPⅡ灭活。因此,抑制GCPⅡ活性有望成为内源性神经保护的新策略。在此理论基础上,我们成功建立了GCPⅡ基因剔除小鼠模型,并且证明其在不影响小鼠正常发育的前提下,能减少脑外伤后海马神经元及胶质细胞的退变。本课题采用控制性皮质打击模型,利用高场强磁共振以~1H-MRS方法对GCPⅡ基因剔除小鼠脑外伤后海马进行定量检测,分析神经递质含量,并尝试探讨GCPⅡ基因剔除的神经保护作用机制及其对小鼠颅脑损伤后脑水肿影响的机制。本研究共分为三个部分。第一部分:小鼠控制性皮质打击模型的建立和分级;第二部分:GCPⅡ基因剔除小鼠和野生型小鼠中度颅脑外伤后海马区域谷氨酸和NAA的含量差异探究;第三部分:GCPⅡ基因剔除对小鼠颅脑外伤后继发性脑水肿的影响。第一部分小鼠控制性皮质打击模型的建立和分级目的:应用精细颅脑打击仪制作小鼠脑皮质损伤模型,跟据检测的结果对脑组织损伤程度进行分级,以建立稳定、可重复的小鼠颅脑外伤模型,并为后续小鼠脑损伤后相关研究提供可靠的基础。方法:将48只雄性C57/BL小鼠(由上海南方模式生物研究中心提供,8-12周龄,体重20-25g)按照随机数字法分为4组,其中假外伤组1组,外伤组3组。应用PinPoint?PCI3000精细颅脑撞击仪(Hatteras Instruments Inc.USA)制造控制性皮质损伤模型。其中,外伤组打击深度分别设置为0.5 mm,1.0 mm和1.5 mm;打击速度设置为3.0 m/s;打击持续时间180 ms,垂直打击小鼠脑皮质,骨瓣不还纳,缝合皮肤切口。假外伤组小鼠仅在与外伤组小鼠相同位置去除骨瓣而不给予打击,缝合皮肤伤口。致伤后观察小鼠基本生命体征,昏迷时间及神经反射情况。损伤后24h,用Evans Blue法估算个小鼠的血脑屏障损伤程度,初步建立小鼠不同程度外伤分级模型。结果:小鼠颅脑损伤程度与打击深度成正相关。随着打击深度的增加,皮质受损加重,小鼠复苏时间逐渐延长(p<0.01),疼痛反射及翻正反射抑制时间逐渐延长(p<0.01)。Evans Blue检测显示假外伤组未发现明显血脑屏障破坏;随着损伤程度的加深,打击区域及其周围皮质血脑屏障破坏程度明显增加。在打击速度和持续时间相同的情况下,打击深度为0.5 mm时模拟轻度颅脑损伤;打击深度为1.0 mm时模拟中度颅脑外伤;打击深度为1.5mm时模拟重度颅脑外伤。结论:利用精细颅脑打击仪能建立稳定可靠的控制性皮质打击小鼠模型,并且可根据打击深度分级,为更好地研究颅脑外伤的病理生理机制提供了可靠的模型基础。第二部分 GCPⅡ基因剔除小鼠和野生型小鼠中度颅脑外伤后海马区域谷氨酸和NAA的含量差异探究目的:在中度颅脑损伤小鼠模型的基础上,探究GCPⅡ基因剔除对小鼠颅脑外伤后谷氨酸和NAA的影响。方法:雄性GCPⅡ基因剔除小鼠及同窝出生的野生型小鼠各12只,随为野生型假外伤组(WT+Sham)、野生型外伤组(WT+TBI)、基因剔除假外伤组(KO+Sham)、基因剔除外伤组(KO+TBI)。应用控制性皮质打击仪制作中度颅脑外伤模型。伤后24h,运用7特斯拉磁共振扫描仪器(Biospec USR70/20,Bruker,Germany)对每组小鼠双侧海马区域(包含CA2/3区域)进行1H-MRS检测,并运用Mest Re Nova软件(Mestrelab Research,Spain)分析各组小鼠海马区域神经递质含量,后作出统计分析。结果:颅脑外伤后野生型小鼠(WT+TBI)损伤侧海马区域谷氨酸相对含量较假损伤组(WT+Sham)明显升高(p<0.05);而NAA相对含量则明显降低(p<0.05),损伤对侧海马区域无明显降低(p>0.05)。GCPⅡ基因剔除小鼠颅脑外伤后也呈现出相似变化(p<0.05,vs KO+Sham),但谷氨酸升高程度和NAA降低程度均较野生型明显减轻(p<0.05,vs WT+TBI)。结论:GCPⅡ基因剔除能显著抑制小鼠脑外伤后海马区域谷氨酸浓度升高和NAA浓度降低。第三部分GCPⅡ基因剔除对小鼠脑外伤后脑组织水肿的影响目的:在中度颅脑损伤小鼠模型的基础上,探讨GCPⅡ基因剔除对小鼠颅脑外伤后脑组织水肿的影响。方法:雄性GCPⅡ基因剔除小鼠及同窝出生的野生型小鼠各12只,随机分为野生型假外伤组(WT+Sham)、野生型外伤组(WT+TBI)、基因剔除假外伤组(KO+Sham)、基因剔除外伤组(KO+TBI),每组小鼠6只。应用控制性皮质打击仪制作中度颅脑外伤模型。脑损伤后24h运用7特斯拉磁共振扫描仪器(Biospec USR70/20,Bruker,Germany)对每组小鼠脑组织进行T2成像检测,观测各组小鼠脑组织水肿情况,随后将其处死,取出脑组织,测量干湿重比值,并进行统计学分析。结果:颅脑外伤后小鼠损伤区域及其周围皮质水肿明显,GCPⅡ基因剔除外伤组小鼠皮质水肿范围明显较野生型外伤组小鼠少。干湿重法分析分析结果显示,与野生型脑外伤小鼠相比,GCPⅡ脑组织水含量明显较低(p<0.05,vs WT+TBI)。结论:GCPⅡ基因剔除能明显减轻小鼠脑损伤区域及其周围皮质的水肿程度。