miR-26a和miR-181a在鸡马立克氏病肿瘤形成过程中的作用机制研究

来源 :中国农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:li875
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miRNAs是一类高度保守的内源性非编码RNA,作为重要的转录后调节因子参与细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、免疫应答等多种生物过程。前期研究中,通过Solexa深度测序筛选得到多个与马立克氏病(MD)肿瘤形成相关的miRNA。本研究,选取上述试验中在肿瘤样本中显著下调的gga-miR-181a和gga-miR-26a作为研究对象,利用CCK-8和trans-well小室的方法检测gga-miR-181a和gga-miR-26a对MSB-1细胞增殖和迁移的影响。研究发现,MSB-1细胞过表达gga-miR-26a和gga-miR-181a后,MSB-1细胞增殖速度显著下调。同时,过表达gga-miR-26a和gga-miR-181a后,MSB-1细胞迁移能力也有所下降。该结果表明gga-miR-26a和gga-miR-181a;对马立克氏病肿瘤细胞的增殖和迁移具有抑制作用。为深入研究gga-miR-26a和gga-miR-181a在马立克氏病肿瘤形成过程中的作用机制,我们对gga-miR-26a和gga-miR-181a的靶基因进一步筛选验证。利用Targetscan和miRDB两个在线软件对gga-miR-26a和gga-miR-181a的靶基因进行生物预测分析,选定BTBD3、KIF3B、ANP32A、CNOT2等4个gga-miR-181a候选靶基因和NRC6B、NEK6、KPNA2、MAPK6、EZH2等5个gga-miR-26a候选靶基因进行双荧光素酶报告基因检测系统分析。研究发现,gga-miR-181a可显著抑制含KIF3B3’-UTR区、ANP32A3’-UTR区和BTBD33’-UTR的报告基因的活性,分别下调上述基因报告基因活性的20%、40%、15%。gga-miR-26a可显著抑伟JNEK63’-UTR区的报告基因活性,使其下调20%。说明gga-miR-181a与预测靶基因BTBD3、KIF3B、ANP32A之间存在相互作用,gga-miR-26a与NEK6基因间存在相互作用,可能参与肿瘤发生过程。研究进一步验证了上述miRNA靶基因的有效性。通过对MSB-1细胞进行转染处理,利用实时荧光定量PCR和western blot的方法测定细胞和组织样品中BTBD3、KIF3B、ANP32A和NEK6等4个预选靶基因的mRNA和蛋白表达情况。确定候选靶基因与miRNA之间的相互关系。结果表明,MSB-1细胞过表达gga-miR-26a后,NEK6的mRNA和蛋白表达显著下调。过表达gga-miR-181a后,ANP32A的mRNA和蛋白表达显著下调。此外,攻毒的肿瘤化脾脏和肝细胞淋巴瘤中ANP32A的mRNA表达水平显著高于对照组,而NEK6mRNA的表达水平呈增高的趋势,但差异不显著。两者与其相应靶基因的表达呈负相关趋势。综上可知,NEK6、ANP32A分别为gga-miR-26a和gga-miR-181a的直接靶基因。综上所述,本研究证明了gga-miR-26a和gga-miR-181a;对MSB-1细胞增殖和迁移具有抑制作用,同时,gga-miR-26a和gga-miR-181a通过对其靶基因NEK6、ANP32A的调控参与马立克氏病肿瘤形成过程。
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