随着世界人口不断增长，可耕土地的严重盐渍化，粮食产量和供给的矛盾日益突出。研究生物耐盐分子机制、利用基因工程方法提高作物的耐盐能力具有十分重要的意义。盐藻是一种极端耐盐的真核绿藻，具有惊人的渗透调节能力，是研究耐盐分子机制的模式生物。甘油是盐藻体内的渗透调节物质，盐藻通过迅速调节细胞内甘油的浓度来维持高盐胁迫下细胞内外的渗透压平衡。研究表明甘油合成途径中的关键酶是甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)，而盐藻在高盐胁迫下合成甘油的关键酶则是叶绿体型NADH依赖的GPDH(NADH-GPDH)。因此，盐藻叶绿体型GPDH的克隆与功能分析是研究盐藻渗透调节分子机制的关键。 本文我们从盐藻(Dunaliella viridis)cDNA文库中克隆到两个具有最高表达特征的GPDH基因DvGPDH1和DvGPDH2，分别编码了695和701个氨基酸，属于NADH-GPDH型。通过对DvGPDH1和DvGPDH2蛋白进行序列分析发现，它们除了具有GPDH保守结构域，在两个蛋白的N端还具有额外的约300个氨基酸的SERB（丝氨酸-3-磷酸酯酶）保守结构域，而该结构域在高等植物和动物的GPDH中是不存在的。因此，DvGPDH1和DvGPDH2是一类独特的具有SERB-GPDH双结构域的基因。亚细胞定位分析表明DvGPDH1和DvGPDH2蛋白定位于细胞的叶绿体中并在具有保守的叶绿体转移肽，因此我们克隆到的DvGPDH1和DvGPDH2编码一类独特的具有SERB-GPDH双结构域的叶绿体型甘油-3-磷酸脱氢酶。 通过对DvGPDH1和DvGPDH2蛋白进行进化分析，发现这种SERB-GPDH双结构域GPDH只存在于绿藻中，且SERB-GPDH双结构域紧紧形成一个独立的进化分支，它们的GPDH结构域和高等植物中的NADH-GPDH进化关系最近。这表明SERB-GPDH双结构型GPDH可能是在绿藻的祖先中就形成了，并且是在绿藻和高等植物分化之后形成的。 为了确认DvGPDH1和DvGPDH2蛋白中GPDH结构域和SERB结构域的功能，我们通过酵母突变体功能互补的方法对两个蛋白进行了功能分析。结果表明，DvGPDH1和DvGPDH2基因都能成功互补酵母GPDH基因突变体gpd1△，证明了它们编码的蛋白都具有GPDH活性；而这两个基因都不能互补酵母SERB突变体ser2△和大肠杆菌SERB突变体SK472，这表明DvGPDH1和DvGPDH2蛋白不具有SERB活性。但是，DvGPDH1和DvGPDH2基因在缺失SERB结构域区段后能更好的互补突变体gpd1△，这表明SERB结构域很可能是一个调节结构域，功能是调节DvGPDH1和DvGPDH2蛋白的GPDH活性。 为了研究DvGPDH1和DvGPDH2在盐藻渗透调节过程中的作用，我们利用Q-PCR的方法对这两个基因在不同盐胁迫下的表达模式进行了分析。在稳定生长于不同盐浓度下的盐藻细胞中，DvGPDH1和DvGPDH2的表达随着细胞外盐浓度的升高(0.5-2M)而逐渐升高；但当细胞外盐浓度升至3M以上(3M-5M)时，两个基因的表达受到抑制。当盐藻细胞经受0.5M→1.5M盐震荡胁迫后，DvGPDH1和DvGPDH2的表达模式呈现出三个不同的阶段：早期基因表达诱导阶段，中期基因表达抑制阶段，后期基因表达回复阶段。这说明在盐震荡条件下盐藻GPDH基因在转录水平上受到调控，同时揭示了基因的表达受到产物反馈抑制调控。比较DvGPDH1和DvGPDH2基因的表达模式，我们发现DvGPDH2基因的表达相对较高，在盐胁迫下更为稳定并且对于产物反馈抑制调控更为不敏感，这表明DvGPDH2可能编码的是盐藻中“渗透条件型”的GPDH。 为了探讨DvGPDH1和DvGPDH2基因在转基因植物方面的应用，我们构建了CaMV35S启动子驱动DvGPDH1和DvGPDH2基因的植物表达载体，通过农杆菌介导的植物转化，获得了转DvGPDH1和DvGPDH2基因的拟南芥，为利用DvGPDH1和DvGPDH2培育耐盐转基因植物打下了基础。