基于构型转换的核酸探针新传感体系研究

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核酸探针技术作为现代分子生物学的一种基本技术手段,与常规生物检测方法相比,具有选择性好、灵敏度高、稳定性强、分析速度快等优点。利用核酸探针,人们开创了一系列新的检测方法,并广泛应用于化学、生物学、食品、环境监测和医学诊断等各领域。基于核酸构型转换,结合电化学检测方法或光学检测方法,本文通过设计不同类型的核酸探针,完成了以下四项研究工作,简述如下:  β-吲哚乙酸(IAA)作为一种调节植物生长和发育的植物激素,它的许多生理效应都与其浓度密切有关。在第2章中,基于间接免疫竞争反应的机理,将末端标记技术和单链DNA的弹性结构结合起来,构建了一种功能核酸探针,并通过电化学检测手段以达到对β-吲哚乙酸的特异性检测。该方法不仅有效回避了很多传统小分子检测方法的缺陷与不足,如高效液相色谱法或毛细管电泳法需要依赖昂贵的精密专用仪器,或样品前处理复杂,同时结合抗体-抗原的特异性反应,实现了简单、低成本、特异性检测β-吲哚乙酸小分子的目标。这种基于单链DNA弹性结构变化的信号转换传感技术,界面灵活,可广泛用于其他多种基底材料中。  可卡因除了作为药用麻醉药外,其对中枢神经有较大的毒性,反复使用,可迅速成瘾,是一种非常普遍的毒品。为了紧密配合中国的禁毒需要,在第3章中,在可卡因适配体序列的基础上,将5’端延长,并加入了核酸切割酶的识别位点和标有双荧光基团的分子信标,构建了一种基于适配体构型转换的分子机器荧光探针。利用适配体与可卡因靶分子结合的特异性和亲和力,使长链自身折叠并通过聚合酶的扩增放大作用和核酸切割酶的特异识别作用,实现了光信号的放大。采用信号/模板一体化的设计思路,有效减少了“信号损耗”。实验结果表明,该检测方法选择性好,动力学响应范围为8.0×10-7M到8.0×10-2 M。  核酸碱基突变与人类许多遗传疾病有关,在遗传学、疾病的发病机理研究及早期诊断与治疗等方面,单核苷酸多态性(SNP)的识别和定量分析越来越受到广泛的重视。在第4章中,采用上述的信号/模板一体化的设计思路,结合邻近分析手段,构建了一种“Y型”探针,可实现对目标DNA的低背景、高灵敏检测。同时该探针具有较强的单碱基错配识别能力。当有目标DNA存在时,可以和辅助探针协同打开分子信标的发夹型结构,三者相互杂交形成“Y型”探针。在聚合酶和核酸切割酶的共同作用下,从而实现了真正的目标DNA诱发酶切循环的信号放大。与荧光标记的直线型探针相比更加灵敏,检测下限为10 pM。  G-四链体是端粒DNA末端富G重复序列形成的特殊二级结构,其在端粒酶催化延长端粒DNA的过程中发挥重要作用,逐渐成为抗肿瘤药物设计开发肿瘤治疗和的重要靶点。在第5章中,发现了一种无猝灭基团、分子间平行G-四链体荧光探针的传感体系。这种富G核酸探针可以有效猝灭荧光信号,通过将这种探针与一条无标记的分子信标杂交,可实现对其结构和荧光信号的调控。该传感体系具有良好的选择性和灵敏度,对实际样品目标DNA的最低检测下限可达5nM,并且能对分子信标进行其他方式的修饰,可用于其它目标分子,如金属离子、蛋白质或非核酸配体目标的检测,在开发优良性能的分析体系方面提供了新思路。
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