目的:类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种对称性外周关节炎为主的系统性疾病。关节持续性炎症反应会导致患者关节不可逆的破坏,畸形以及功能的丧失。RA发生和发展的关键环节是关节滑膜中成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS),FLS的免疫损伤作用主要是通过自身释放炎性因子以及募集炎性细胞释放炎性因子。深入研究与FLS相关的信号通路及影响因素,可以为以FLS为靶点防治RA提供新的思路。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号在RA的发生发展中起重要作用。MAPK的三个主要亚家族:c-Jun N末端激酶(JNK)、细胞外调节激酶(ERK)和p38激酶。JNK信号通路在许多生物学过程中参与炎症反应。许多研究表明JNK活化在RA发生发展中的作用。JNK激活参与基质金属蛋白酶(MMP)基因表达的转录因子,从而增加MMP的产生,促进FLS的侵袭和关节的破坏,提示JNK活化是类风湿关节炎发病的重要因素。咖啡因是甲基黄嘌呤类的中枢神经系统(CNS)兴奋剂。有报道指出咖啡因对RA患者治疗所用的甲氨蝶呤(MTX)有潜在的拮抗作用。一项荟萃分析表明,饮用咖啡与血清阳性RA风险之间存在显著关联。这些报道提示咖啡因可能在RA发病过程中发挥作用。探讨咖啡因在RA发展过程中的作用机制可能为RA的治疗开辟新的思路。因此,探究咖啡因调控RA进程的机制对防控RA具有重要的意义。本博士论文拟对咖啡因对RA-FLS增殖和侵袭的影响及其分子机制展开研究,探讨咖啡因促进RA进展的理论基础。研究方法:本文以类风湿关节炎患者手术切除的滑膜组织为样本,分离培养人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞。通过MTT实验检测咖啡因对RA-FLS增殖的影响且与剂量的关系。通过细胞侵袭实验检测咖啡因对RA-FLS侵袭能力的影响且与剂量的关系。探讨咖啡因诱导FLS生长和侵袭的可能机制,采用Western blot和实时PCR技术检测不同浓度咖啡因对RA-FLS中细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、MMP2和MMP9转录和表达的影响。为进一步研究咖啡因促RA-FLS增殖的分子机制,采用Western blot检测不同浓度咖啡因对RA-FLS中p-JNK、ATF2、c-jun和p-p65蛋白表达的影响。利用JNK信号通路抑制剂Anthrapyrazolone(SP600125),采用MTT法检测SP600125对咖啡因诱导的FLS增殖的影响。通过细胞侵袭试验检测SP600125对咖啡因促RA-FLS侵袭能力的影响。采用Western blot检测SP600125对咖啡因促RA-FLS中JNK下游蛋白MMP2、MMP9、cyclin D1、cyclin E、c-jun和ATF2蛋白表达的影响。结果:采用不同浓度的咖啡因(0、250、500和750μg/ml)处理细胞48小时,在0、24、48、72和96小时检测细胞生长速度。咖啡因处理组以剂量依赖的方式显著促进FLS的增殖。同样采用不同浓度的咖啡因(0、250、500和750μg/ml)处理细胞48小时,然后将细胞接种于基质凝胶中约20小时,观察其侵袭能力,结果显示咖啡因以剂量依赖的方式促进RA-FLS的侵袭。咖啡因还以剂量依赖的方式上调细胞周期素D1、细胞周期素E、MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达。此外,咖啡因对磷酸化JNK和JNK靶蛋白水平有显著的上调作用,提示咖啡因可诱导JNK活化。咖啡因处理后的RA-FLS,JNK下游靶点ATF2和c-jun上调,提示咖啡因能激活RA-FLS的JNK信号通路。此外,采用咖啡因处理FLS 48小时,再将JNK特异性抑制剂SP600125加入培养基(浓度5μM和10μM)中24小时。取细胞进行western blot、MTT和细胞侵袭试验。结果显示,SP600125处理抑制了细胞生长速率。细胞侵袭实验表明,与单用咖啡因处理组相比,SP600125处理组显著降低了FLS的侵袭细胞数。此外,SP600125也剂量依赖性地抑制p-JNK、MMP2、MMP9、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、ATF2和c-jun的表达。这些数据表明JNK抑制能逆转咖啡因在FLS中的生物学作用。JNK抑制剂SP600125可抑制咖啡因对FLS增殖和侵袭的影响。SP600125还以剂量依赖的方式阻断JNK下游靶点的表达。结论:咖啡因能促进RA-FLS的生长和侵袭。咖啡因还以剂量依赖的方式上调细胞周期素D1、细胞周期素E、MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达。咖啡因对磷酸化JNK和JNK靶蛋白水平有显著的上调作用,提示咖啡因可诱导JNK活化。JNK抑制剂SP600125可抑制咖啡因对FLS增殖和侵袭的影响。SP600125还以剂量依赖的方式阻断JNK下游靶点的表达。本研究结果表明,咖啡因通过激活JNK信号通路促进FLS的增殖和侵袭,提示咖啡因在类风湿关节炎发生发展中的作用。