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重症肺炎是指除有肺炎常见的呼吸道症状外，同时累及其他系统而出现的临床症状。婴幼儿因肺炎住院、死亡的居我国儿科病例中住院数和住院死亡数的首位，且多数死于重症肺炎。腺病毒是引起婴幼儿重症肺炎的重要病原。为了了解腺病毒的感染同重症肺炎的关系，本研究从重症肺炎死亡的婴幼儿肺组织蜡块标本中提取DNA，采用针对腺病毒六邻体的巢氏PCR引物扩增腺病毒六邻体基因，将阳性的PCR产物进行克隆、测序，并针对这些肺组织蜡块标本进行免疫组织化学检测。175例肺组织蜡块标本中，经巢氏PCR检测阳性病例有16例，阳性率为9.14％；巢氏PCR和免疫组织化学方法同时检测阳性的有4例，阳性率为2.29％。将经巢氏PCR检测到的阳性样本的序列提交到Genbank中进行BLAST分析，其中3例为3型腺病毒、12例为4型腺病毒、1例为41型腺病毒。结果表明腺病毒是引起重症肺炎的重要病原，4型腺病毒是广州地区引起重症肺炎腺病毒的主要血清型，3型腺病毒有一定的感染比例。
⑴从该重症肺炎病例的尸检脑、肝、肺、肠、脾组织中抽提DNA进行腺病毒六邻体的巢氏PCR扩增，对PCR产物进行克隆、测序，同时用免疫组织化学方法检测肺组织中腺病毒、支原体、衣原体、呼吸道合胞病毒、A型流感病毒和B型流感病毒。结果表明除腺病毒外的病原检测结果都为阴性，肺和肠中腺病毒巢氏PCR检测结果为阳性，测序表明为41型腺病毒。这说明肠道腺病毒41型感染可能是婴幼儿重症肺炎的病因之一。
⑵从疑似流感患儿身上取样，经荧光定量RT-PCR检测证实为B型流感病毒。设计引物，应用RT-PCR方法扩增得到该株病毒的8个片段，分别将其克隆到T克隆载体进行测序，将8个片段同国际代表株进行序列比对和进化分析；从Genbank中提取中国大陆不同时期的HA基因序列和国际代表株序列，应用系统发育分析软件建立HA基因的系统发育树并进化分析。分析表明广州株PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、MP、NA片段的长度分别为2370、2396、2305、1882、1844、1557、1190、1097nt。新分离的B型流感病毒广州株在分类上属于Yamagata系，进化上属于patternⅢ(Ya+Ya+Ya+Ya+Ya+Ya+Ya+A)模式；从80年代末期开始，中国大陆流行的B型流感病毒分别属于Victoria系或者Yamagata系，90年代和00年代同时存在Victoria系和Yamagata系的流行。结果表明广州地区07年存在B型流感病毒Yamagata系的流行，分离株可能来源于patternⅠ和patternⅡ的重组；中国大陆地区90年代和00年代Victoria系和Yamagata系B型流感病毒的流行比例相当，时间规律不明显。
⑶针对HA基因序列设计引物，用PCR方法扩增得到HA基因，分别用KpnⅠ和XbaⅠ对HA基因和穿梭质粒pShuttle—CMV双酶切后连接，构建重组穿梭质粒pShuttle—CMV—HA，然后在大肠杆菌BJ5183内进行经PmeⅠ线性化的pShuttle—CMV—HA和骨架质粒pAdEasy—1的同源重组，通过筛选鉴定得到重组腺病毒质粒pAdEasy—HA，将重组腺病毒DNA经PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染AD—293细胞，在细胞内包装成含有HA基因的重组腺病毒rAdV5—HA，并且通过病变观察、扫描电镜、RT-PCR、Western blot对基因组的包装和HA基因的表达进行检测。最终转染后的AD—293细胞发生病变，并且检测到HA基因的表达，成功构建了带有HA基因的重组腺病毒rAdV5—HA，为B型流感病毒活载体疫苗的研究提供了依据。
⑷构建了包含有B型流感病毒HA基因的重组3型腺病毒，将HA在3型腺病毒中进行表达。用PCR方法扩增得到HA基因，酶切后克隆至3型腺病毒穿梭质粒pSK—CMV，构建重组穿梭质粒pSK—CMV—HA，然后在大肠杆菌BJ5183内进行经NotⅠ和EcoRⅤ线性化的pSK—CMV—HA和经RsrⅡ线性化的骨架质粒pBRAdV3△E3的同源重组，AsiSⅠ酶切线性化重组腺病毒质粒pBRAdV3△E3—HA后脂质体法转染HEp—2细胞，进行病毒包装和增殖后得到重组腺病毒rAdV3△E3—HA，并且通过病变观察、扫描电镜、RT-PCR、免疫细胞化学方法对基因组的包装和HA基因的表达进行检测。结果表明线性化的pBRAdV3△E3—HA转染HEp—2细胞观察到细胞病变和HA基因的表达，并对5型和3型腺病毒的表达效果进行了比较。证实成功构建了带有HA基因的重组腺病毒rAdV3△E3—HA，为B型流感病毒—3型腺病毒二联活苗的研究提供了候选分子和理论依据。