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研究背景：成纤维细胞转化为肌成纤维细胞是增生性瘢痕形成过程中重要的病理变化。研究证明转化生长因子-β1(TGF-β1)在成纤维细胞转化过程中起中心作用。TGF-β1结合成纤维细胞膜上的TGF-βⅡ型受体后，与磷酸化的TGF-βⅠ型受体形成异源二聚体复合物，该聚合体进一步活化Smad2和Smad3,并与Smad4形成异源寡聚体，转运到细胞核内，与平滑肌肌动蛋白-α（α-SMA）基因的启动部分结合表达α-SMA成为肌成纤维细胞。近期研究发现TGF-β1与细胞膜结合以后，细胞内活性氧（ROS）的产生及释放增加，是其刺激成纤维细胞转为肌成纤维细胞一个重要的信号途径。褪黑激素是一种由松果体分泌的神经内分泌激素，具有调控细胞周期、分化和凋亡、抗肿瘤、调节昼夜节律、抗氧化和清除自由基等作用。皮肤是褪黑激素的靶器官，同时皮肤本身和皮肤细胞能产生褪黑激素并表达褪黑激素受体，因此，褪黑激素在维护皮肤正常结构和功能中起重要作用。本课题组前期研究发现增生性瘢痕组织中褪黑激素的含量降低，组织褪黑激素受体表达异常；细胞研究显示褪黑激素可抑制瘢痕成纤维细胞的增殖，同时促进瘢痕成纤维细胞的凋亡，结果提示皮肤局部组织褪黑激素系统功能失调与增生型瘢痕形成有关。成纤维细胞转化为肌成纤维细胞是增生性瘢痕形成过程中的重要病理变化，因此，本研究进一步探讨褪黑激素对增生性瘢痕成纤维细胞转化的影响及机理。第一部分褪黑激素对增生性瘢痕成纤维细胞α-SMA、TGF-βⅠ型受体表达的影响目的研究褪黑激素对增生性瘢痕成纤维细胞转化的影响。方法收集6例增生性瘢痕组织，采用组织块法进行成纤维细胞分离培养，细胞传代培养至第3-6代，细胞分为两组：对照组（单纯培养基）和褪黑激素组（10-3mM），培养48h。采用Western-Blot技术检测成纤维细胞α-SMA、TGF-βⅠ型受体蛋白的含量，RT-PCR技术检测成纤维细胞α-SMA、TGF-βⅠ型受体mRNA的表达。本实验采用配对t检验进行数据统计。结果褪黑激素作用于增生性瘢痕成纤维细胞后，成纤维细胞α-SMA和TGF-βⅠ型受体蛋白含量分别为0.40±0.08和0.46±0.25，明显低于对照组（0.80±0.13和0.55±0.30，P＜0.05），同时α-SMA和TGF-βⅠ型受体mRNA的表达（0.16E-2±0.22E-2和11.85±1.17），低于对照组（0.50E-2±0.57E-2和17.15±0.58，P＜0.05）。结论研究数据显示褪黑激素可抑制增生性瘢痕成纤维细胞的转化。第二部分褪黑激素对TGF-β1刺激正常皮肤成纤维细胞转化作用的影响目的探讨褪黑激素影响成纤维细胞转化的作用机制。方法收集6例正常皮肤组织，采用组织块法进行成纤维细胞分离培养，细胞传代至第3-6代，细胞分为四组：对照组（单纯培养基）、TGF-β1组（10ng/ml）、褪黑激素组(10-3mM)、TGF-β1组（10ng/ml）+褪黑激素组（10-3mM），培养72h。采用Western-Blot技术检测成纤维细胞α-SMA、TGF-βⅠ型受体蛋白含量。RT-PCR检测成纤维细胞α-SMA、TGF-βⅠ型受体mRNA的表达。本实验采用S-N-K进行数据统计。结果TGF-β1刺激后，正常皮肤成纤维细胞中α-SMA蛋白含量为0.86±0.02，α-SMAmRNA表达量为1.18±0.79，均高于对照组(0.41±0.03和0.50±0.38，P＜0.05)；TGF-β1刺激后再加用褪黑激素，成纤维细胞中α-SMA蛋白含量为0.22±0.01及α-SMAmRNA表达量为0.16±0.07，均低于TGF-β1组（P＜0.05)。TGF-β1刺激后，正常皮肤成纤维细胞中TGF-βⅠ型受体蛋白含量为0.72±0.09，TGF-βⅠ型受体mRNA表达量为5.86±3.41，均高于对照组（0.13±0.05和4.15±2.74，P＜0.05)；TGF-β1刺激后再加用褪黑激素，成纤维细胞中TGF-βⅠ型受体蛋白含量为0.22±0.16及TGF-βⅠ型受体mRNA表达为0.16±0.07，均低于TGF-β1组（P＜0.05)。结论实验结果表明褪黑激素是通过抑制TGF-β1的作用进而影响成纤维细胞的转化。第三部分褪黑激素对增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞TGF-β1作用后ROS及抗氧化酶的影响目的探讨褪黑激素抑制TGF-β1刺激成纤维细胞转化作用的机制。方法收集6例增生性瘢痕和6例正常皮肤组织，采用组织块法进行成纤维细胞分离培养，细胞传代至第3-6代，增生性瘢痕成纤维细胞分为两组：对照组（单纯培养基）和褪黑激素组（103mM）；正常皮肤成纤维细胞分为四组：对照组（单纯培养基）、TGF-β1组（10ng/ml）、褪黑激素组(10-3mM)、TGF-β1组（10ng/ml）+褪黑激素组（10-3mM）。在细胞爬片基础上，采用免疫荧光技术标记成纤维细胞中ROS，ELISA法检测成纤维细胞MDA的含量和SOD的活性。本实验采用配对t检验或S-N-K进行数据统计。结果增生性瘢痕成纤维细胞中，与对照组比较，褪黑激素组细胞绿色荧光强度降低，细胞内MDA的含量降低（1.38±0.31）nmol/mgprot（P＜0.05），SOD的活性升高（2.63E1±0.713）U/mgprot（P＜0.05）。TGF-β1刺激后正常皮肤成纤维细胞绿色荧光的信号增强，同时MDA的含量升高（0.86±0.06）nmol/mgprot（P＜0.05），SOD的活性降低（192.47±11.91）U/mgprot（P＜0.05）；褪黑素可以阻断TGF-β1的作用，细胞内MDA的含量显著降低（0.723±0.103）nmol/mgprot（P＜0.05），SOD的活性升高（241.20±25.734）U/mgprot（P＜0.05）。结论褪黑激素可阻断成纤维细胞TGF-β1刺激后ROS的释放，同时可以提高SOD的活性，表明褪黑激素通过抑制TGF-β1下游信号通路，影响TGF-β1对成纤维细胞的转化。