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菜用大豆属豆科,大豆属,栽培大豆种[Glycinemax(L.)Merr.],也称毛豆、枝豆。因其营养价值高,深受消费者青睐。然而,与大豆一样,菜用大豆也是主要致过敏食物之一。其种子蛋白中含有的GlymBd30K,是一个显性过敏原,65%以上对大豆敏感的病人仅对GlymBd30K蛋白过敏。以菜用大豆‘NY-1001’为材料,利用RNA干扰技术,试图通过对GlymBd30K基因表达的抑制,获得GlymBd30K基因沉默的转基因植株。主要研究结果如下: 1.以菜用大豆‘NY-1001’的RNA为模板,经RT-PCR反转录,扩增并克隆大豆过敏蛋白基因(GlymBd30K)长度为395bp的反义、正义基因片段。过氧化氢酶内含子为间隔区,将GlymBd30K反义基因片段、内含子和GlymBd30K正义基因片段通过酶切位点连接在一起,将全长为1012bp的发卡结构插入载体pCAMBIA3301,构成可表达双链RNA的植物干扰载体pCAMBIA3301-30K-RNAi。 2.不同共培养时间和筛选剂bialaphos的浓度对农杆菌介导菜用大豆子叶节遗传转化效率的研究结果表明,共培养4天,GUS的瞬时表达效率和转化芽的再生率最优。共培养结束一周后加入筛选剂bialaphos,浓度为4mg·L-1。 3.通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法,以bialaphos为筛选剂,获得3份可遗传的转基因材料。PCR分析、GUS组织化学染色和Basta抗性鉴定表明转基因性状稳定地遗传给后代。Southern杂交显示,转基因的特性以单拷贝形式遗传给后代,且符合3∶1孟德尔遗传规律。通过qRT-PCR检测,籽粒发育期的GlymBd30K基因mRNA的表达显著受到抑制,只有痕量的mRNA表达;Westernblot分析表明成熟种子GlymBd30K蛋白的合成完全受到抑制。研究结果显示获得了GlymBd30K蛋白缺失的转基因菜用大豆新种质并证实RNA干扰技术可有效敲除菜用大豆过敏原基因GlymBd30K。