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低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension,HPH）是以肺小动脉收缩及重构为主要特征的慢性渐进性疾病,多见于慢性呼吸系统疾病以及原发性高原病,是肺动脉高压（pulmonary hypertension,PH）的一种较常见类型。长期、持续的肺动脉高压,可诱发右心衰竭最终导致患者死亡。低氧性肺动脉重构作为HPH最显著的病理改变,是肺动脉压力持续升高的重要因素。尽管目前有多种药物可应用于肺动脉高压的治疗,但大都不能有效地抑制或逆转肺动脉重构的发生。近年来有大量研究表明,恢复常氧后,低氧性肺动脉重构尤其增厚的肺动脉中膜层,可逐步逆转。关于肺动脉重构的逆转过程,即增厚的肺动脉壁的逐渐变薄,我们推测此细胞数目减少的过程一定与“死亡大于新生的细胞数”有关。只有在此种情况下,肺血管壁上增多的细胞,才能被有效的清除掉,而最终达到肺血管壁逆转的目标。所以,复氧期“细胞死亡”与“细胞增殖”间平衡的动态变化,将是影响肺动脉重构逆转的关键因素。目前,已知的细胞死亡方式,主要有凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）、坏死（necrosis）及程序性坏死（necroptosis）等。那么在低氧性肺动脉重构复氧逆转的过程中,究竟是“细胞死亡”还是“细胞增殖”的改变导致了肺动脉重构的逆转,目前尚不清楚。对于有氧代谢的细胞,低氧、复氧作为较常见的应激性刺激,常可影响其正常的代谢过程进而导致细胞功能的紊乱、甚至死亡。例如,在心肌缺血再灌注（低氧-复氧）损伤中,常伴有氧化呼吸爆发及ROS的大量产生。急剧增多的ROS作为一种损伤性因子,可引起细胞内许多大分子物质及细胞器发生严重的损伤,例如线粒体的损伤,最终导致心肌细胞的凋亡。在低氧性肺动脉重构复氧逆转的过程中,是否也伴有严重的氧化应激性损伤,还需进一步研究。【研究目的】1、明确低氧性肺动脉重构在恢复常氧条件后的改变,及其发生的相关机制。2、从氧化损伤的角度,更加深入地探讨低氧性肺动脉重构复氧逆转的分子机制。【研究方法】1、成年雄性SD大鼠随机分为:常氧4周组（normoxia for 4 weeks,N）、低氧4周组（hypoxia for 4 weeks,H）、低氧4周后复氧1周组（reoxygenation for 1 week after hypoxia for 4 weeks,R1）及低氧4周后复氧6周组（reoxygenation for 6 weeks after hypoxia for 4 weeks,R6）。常氧组大鼠,在常氧条件下（21%O2）饲养4周。低氧组大鼠,每天在低压低氧舱内（10%O2）暴露8小时,连续处理4周。复氧组大鼠,在低氧4周干预结束后继续转至常氧条件下分别饲养1周和6周。所有处理结束后,分别检测各组大鼠右室收缩压（right ventricle systolic pressure,RVSP）、右室肥厚指数（RV/（LV+Sep））、肺小动脉中膜厚度（medial thickness,MT）及面积（medial area,MA）等,观察其在低氧-复氧过程中的变化。2、各组肺组织石蜡切片,分别进行TUNEL染色以及免疫组化检测α-SMA、cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2、LC3及P62等在肺动脉中膜中的表达。再者,应用Western blotting法检测各组肺组织中cleaved-caspase3/PARP、Bcl-2、Bax、PCNA、LC3及P62的表达。另外,应用过氧化氢检测试剂盒,分别检测各组肺组织中H2O2的含量。3、取3-5代对数生长期的PASMCs进行低氧（5%O2）干预0、24、36、48、60及72 h,MTT法确定低氧条件下细胞生长最活跃的时间点;然后在此低氧的基础上,将PASMCs转至常氧条件下继续培养0、24、36、48及60 h,观察细胞的生长率在复氧过程中的变化。4、分别使用Annexin V-PI染色、Brd U检测以及Western blotting法,检测PASMCs的凋亡及增殖在复氧过程中的变化。再者,使用Western blotting技术检测PASMCs中LC3及P62的表达,明确其自噬水平在复氧阶段的变化。5、体外培养的PASMCs分别使用DCFH-DA（2’,7’-Dichlorofluorescin diacetate）及Mito SOX Red荧光染料,检测胞内总的ROS及线粒体的ROS（mitochondrial ROS,m ROS）在复氧期的变化。再者,在使用了胞内非特异性ROS清除剂NAC（N-acetylcysteine）和m ROS特异性清除剂Mito TEMPO后,分别观察ROS、m ROS的变化,以确定复氧期胞内ROS的主要来源。另外,直接提取各组PASMCs线粒体,在胞外进一步观察m ROS在复氧过程中的变化。最后,在应用了ROS清除剂后,观察复氧期PASMCs凋亡的变化,以确定复氧期增多的ROS对PASMCs凋亡的作用。6、使用线粒体膜电位（?Ψ）依赖性阳离子染料JC-1,分别检测各组PASMCs中线粒体膜电位在复氧过程中的变化;再者,通过提取各组PASMCs线粒体并检测其ATP合成功能,以确定复氧期ROS/m ROS对线粒体功能的影响。最后,应用Western blotting法分别检测复氧期PASMCs中Bax、Bcl-2的表达,以及Cytochrome C（Cyto C）在胞浆和线粒体内分布的变化等,以确定线粒体功能对复氧期PASMCs凋亡发生的影响。【研究结果】1、RVSP、RV/（LV+Sep）、MT%及MA%等与HPH功能及结构相关的指标,在HPH大鼠被转至常氧条件后,可逐步逆转。2、与低氧组相比,复氧显著增加了中膜PASMCs凋亡,而降低了其自噬及增殖水平。此外,复氧使肺组织中H2O2的水平显著升高。3、MTT结果显示,低氧显著促进了PASMCs的生长,尤其在低氧48小时;当低氧48小时后将PASMCs转至常氧条件下继续培养,可见PASMCs的生长率与常氧组相比显著减慢,特别是低氧48小时后复氧24小时。4、复氧期PASMCs的凋亡及增殖水平均较常氧组显著升高,但凋亡增加的更为显著。复氧期PASMCs的自噬水平,与常氧组无显著差异。5、复氧阶段,PASMCs内总的ROS及m ROS均显著升高;应用了NAC和Mito TEMPO后,总的ROS和m ROS几乎同等程度地降低。同时,分离得到的线粒体的检测结果显示,复氧期m ROS显著升高。此外,清除了ROS及m ROS后,可见复氧阶段PASMCs的凋亡被显著抑制。6、复氧期,PASMCs线粒体膜电位显著降低、线粒体ATP合成功能明显受损,再者线粒体膜间空间的Cyto C大量释放至胞浆。清除了PASMCs中ROS及m ROS后,线粒体的膜电位、通透性水平以及ATP合成能力,基本恢复至正常水平。【研究结论】1、低氧性肺动脉高压特征性病理改变低氧性肺动脉重构,在恢复常氧条件后,可以逐步得到缓解,且PASMCs特异性的凋亡参与了此过程。2、复氧阶段PASMCs内大量产生的ROS,尤其线粒体来源的ROS,诱发的线粒体损伤,最终启动了PASMCs内源性凋亡程序。