利用PCR-DGGE技术检测、鉴定乳酸菌

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乳酸菌广泛存在于人和动物肠道、植物表面等生境中。作为最具代表性的益生菌,乳酸菌在食品发酵、饮品和饲料等领域有着悠久的应用历史。将分子生物学方法引入微生物生态学领域,研究乳酸菌制品中不同乳酸菌及其菌群组成,可以获得发酵过程中乳酸菌菌群组成的动态变化。这对于生产过程的控制、产品质量的检验具有重要意义。本文中采用PCR-DGGE(ploymerase chain reaction and denaturing gredient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术,结合传统的平板分离培养,对一些包含有乳酸菌的发酵产品进行微生物菌群分析,建立了一种快速检测乳酸菌的方法。 对PCR-DGGE技术在分析乳酸菌制剂中的有关实验条件进行探索及优化。首先对变性梯度凝胶浓度及电泳时间进行了研究,结果表明,在进行平行DGGE时,变性剂(尿素及甲酰胺)浓度在30%~55%时,能够有效分离大小相同、碱基组成不同的DNA片断。时间间歇变性梯度凝胶电泳实验结果显示,对乳酸菌16S rDNA可变区的最佳分离时间为200min。通过DGGE法分析了细菌通用引物在PCR扩增不同模板时的产物差异,发现扩增产物量与模板量并没有直接关系,推测主要是引物与模板的结合效率有关。在优化的电泳条件下,选择微生物饲料添加剂中常用的7株益生乳酸菌,建立了它们的DGGE指纹图谱库。 以青贮玉米秸秆饲料为实验材料,对从发酵产品中直接提取总DNA的方法及其效率进行研究。结果表明,采用先分离青贮饲料中微生物,再进行溶菌酶与SDS共同作用裂解细胞的方法,所提取的青贮饲料总DNA纯度较高。用PCR和光吸收方法对所得的DNA质量进行检测,发现得到的DNA中杂质含量少,可用于后续的分子操作。通过DGGE对提取的DNA进行纯度及效率的验证,发现所建立的方法能提取出青贮饲料中所有优势菌群的染色体DNA,没有遗漏。通过向灭菌秸秆中接种不同浓度的已知菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),验证上述方法的可靠性,实验结果表明,在样品中不少于75个微生物的DNA均可被提取出
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