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新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是一种带有荚膜的担子菌。它作为一种条件致病真菌,可以感染免疫缺陷的个体引发致命脑膜炎。针对Cneofprmans如何致病的分子机制已经做了大量的研究工作。C.neoformans中已发现的毒力相关特性主要包括:高温(37℃)条件下的生长能力,含铜漆酶(laccase)的产生和荚膜多糖(capsule)的合成等。
本论文中,以C,neoformans菌株JEC21(血清型D)作为模式来研究漆酶的葡萄糖阻遏抑制(repression)的分子机制。C.neoformans中漆酶的表达受到葡萄糖的抑制,潜在的分子基础还不清楚。我们利用根癌农杆菌介导的转化方法(ATMT)构建了一个T-DNA随机插入突变文库,文库容量大小约为200,000个转化子。葡萄糖去抑制突变株在2％葡萄糖条件下可以合成黑色素,菌落颜色呈黑色或棕色,而野生型菌株JEC21黑色素的合成受到了抑制,菌落颜色呈白色。根据菌落颜色的变化,我们筛选到了30株葡萄糖去抑制突变株,通过Southemblot发现83%的葡萄糖去抑制突变株含有单个T-DNA拷贝,通过反向PCR我们初步鉴定了10个葡萄糖抑制相关基因,还发现3株葡萄糖去抑制突变株中T-DNA破坏了LAC1(编码漆酶)的启动子区。
突变株LZM36中突变基因编码一种tetraspaain蛋白,并且该蛋白属于真菌Tsp2 tetraspanin家族,因此我们把该突变基因命名为TSP2-1(GenBank No.CNJ00820)。C.neoformans中,TSP2-1的缺失会导致黑色素的持续合成和LAC1的持续表达,外源的cAMP(10 mM)不但可以恢复突变株tsp2-1△的去抑制表型,而且还可以恢复其荚膜缺陷。以上这些结果表明,在C.neoformans中,Tsp2-1可能通过依赖cAMP的蛋白激酶A(PKA)信号通路调节漆酶的表达抑制和荚膜的合成。TSP2-1还具有其他功能,例如,维持细胞膜的完整性、压力抗性和致病性减弱等。这是首次对真菌的Tsp2 tetraspanin家族成员Tsp2-1的功能描述。
在本论文中,我们还从突变库中分离到了另一株突变株LZM32。该突变株的菌落形态具有光泽呈流淌的粘液状,疑似产生了过多的荚膜,进一步研究发现突变株LZM32中,T-DNA破坏了一个未知功能的新基因(GenBank No.CNF01870)。该基因编码的蛋白含有一个保守的Zds C结构域(pfam08632,残基594-632),S.cerevisiae和S.pombe中的Zds蛋白也含有保守的Zds C结构域。因此,我们把这个基因命名为ZDS3。通过定向敲除得到了突变株zds3△,突变株zds3△具有和LZM32一样的表型,ZDS3参与维持细胞正常形态,细胞壁的完整性和钙离子耐受力。ZDS3的其他功能包括:侵入性生长,高温的耐受力和抗氧化。ZDS3是C.neoformans荚膜合成所必需的,ZDS3缺失导致zds3△菌株失去了致病性。Zds3的同源蛋白只存在于担子菌和子囊菌中,因此可以作为抗真菌药的靶位。