背景目的:乳腺叶状肿瘤(phyllodes tumor,PT)是一种乳腺的纤维上皮性肿瘤[1],叶状肿瘤好发于中年妇女,35～50岁多见。根据其组织学及生物学特点分为三类,即良性叶状肿瘤、交界性叶状肿瘤和恶性叶状肿瘤。良性叶状肿瘤起病不易察觉,交界性及恶性叶状肿瘤生长迅速。良性、交界性、恶性叶状肿瘤均易复发,复发后的肿瘤,生物学行为更恶,组织学级别更高[2]。恶性叶状肿瘤侵袭性较强,易发生远处转移,最常见的转移部位为肺、骨、脑,发生远处转移的病人其总生存期将明显缩短[3-5]。目前,尚未有关于叶状肿瘤侵袭和转移的生物学标记的相关报道及与肿瘤进展相关的基因报道。肿瘤新生血管的生成和肿瘤的侵袭、浸润、转移密切相关。肿瘤微血管的增生可以通过微血管密度表示。微血管密度计数法通过免疫组化染色方法,对内皮细胞的相关成分进行选择标记,是定量分析肿瘤新生血管的金标准。叶状肿瘤易出现低诊现象,目前尚未有可靠的辅助诊断指标。CD105可以用于新生血管内皮的标记,其特异性和敏感性较CD31、CD34均较强。CD105不仅可以表达在新生血管内皮细胞中,也可表达肿瘤的实质细胞中。叶状肿瘤的间质细胞也可表达。很多肿瘤存在肿瘤内异质性,肿瘤分化差的区域,生物学行为较恶,侵袭性较强,容易引起肿瘤的局部复发和远处转移,影响患者的生存预后。基因表型的不稳定性是导致肿瘤内异质性的主要因素。外显子测序能够帮助我们从大量SNV(单核苷酸变异)位点中筛选出导致肿瘤异质性相关的基因。本论文的研究目的在于探讨分析微血管密度和CD105的表达与叶状肿瘤组织学级别的关系,并分析CD105的表达模式与肿瘤内异质性问题及采用新一代测序的研究手段检测叶状肿瘤内基因型的改变,从基因水平初步探讨肿瘤内异质性的问题。研究方法:1.收集54例叶状肿瘤病例资料,包括临床病理资料,病理诊断切片,肿瘤的石蜡组织标本。通过对临床资料的统计,分析临床病理参数与叶状肿瘤组织学级别的关系。运用免疫组化的方法,对54例叶状肿瘤标本进行CD105的染色,观察微血管密度、CD105间质细胞的表达与叶状肿瘤组织学级别的关系。通过显微镜下对组织学形态的观察与CD105的表达情况及个案报道,分析叶状肿瘤的肿瘤内异质性问题。2.选取收集到的9例叶状肿瘤病例样品,进行全外显子测序以及生物信息学分析,并根据生物学功能、突变频率等因素进一步总结选出感兴趣的基因,为从分子水平探讨肿瘤异质性提供备选基因。研究结果:1.良性叶状肿瘤的微血管密度为18.1,交界性叶状肿瘤的微血管密度为48.1,恶性叶状肿瘤的微血管密度为51.4,交界性和恶性叶状肿瘤的微血管密度显著高于良性叶状肿瘤。2.在11例交界性叶状肿瘤和10例恶性叶状肿瘤中,间质细胞均有不同程度CD105灶性表达,然而在33例良性叶状肿瘤中,只有8例显示了 CD105表达,并且强度较弱。3.在54例叶状肿瘤中,有3例叶状肿瘤的肿瘤内部存在明显组织学分化形态,大部分的肿瘤区域表现为良性分化,小部分肿瘤区域表现为交界性或恶性分化。4.应用外显子测序技术,根据实验组VS.对照组,发现5组比对中,分别有10、17、12、15、8个基因满足要求,每一组均有数量不等的基因发生突变。5.从肿瘤异质性角度分析,通过1对1、5对5比较及根据高频突变基因集、肿瘤驱动基因集的筛选,最终筛选出如下基因:PSMG1、FOSL2及PHGR1、CGB2、FRG1。结论:1.叶状肿瘤组织学级别越高,微血管密度约高。2.叶状肿瘤的组织学级别越高,CD105的表达越明显。3.叶状肿瘤内存在肿瘤内异质性,CD105在间质细胞中呈灶性表达,同一肿瘤内,在组织学级别高的区域表达明显。4.通过外显子测序技术,发现同一肿瘤内,分化差的区域(实验组)相较分化好的区域(对照组)存在基因突变,说明基因的改变与肿瘤异质性密切相关。5.筛选到的基因在一定程度上导致了叶状肿瘤异质性,通过后期扩大样本量进一步证实其作用。