目的:构建pcDNA3.1⁺-SjP14及SjGST真核表达载体,并利用重组质粒免疫小鼠,探讨其对小鼠血吸虫感染的保护作用。方法:1. pcDNA3.1⁺-SjP14及SjGST真核表达载体的构建和鉴定:从日本血吸虫成虫中提取总RNA,逆转录生成cDNA,以其为模板扩增出SjP14和SjGST编码基因,将扩增产物克隆入真核表达载体pcDNA3.1⁺,用双酶切鉴定质粒构建成功与否。该重组质粒转染Hela细胞,RT-PCR和Western blotting检测其体外表达,以验证其能表达出重组蛋白。2. DNA疫苗的制备及保护作用研究:制备无内毒素DNA疫苗,用于免疫小鼠。将雌性BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只,生理盐水组给予100μl/鼠/次;空质粒组100μg/鼠/次;pcDNA3.1⁺-SjP14组,给予100μg/鼠/次;pcDNA3.1⁺-SjP14+ pcDNA3.1⁺-SjGST组分别给予100μg/鼠/次,每2周免疫一次,共3次。末次免疫后2周,经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴（30±1）条/鼠。尾蚴攻击6周后用颈稚脱臼法处死小鼠,收集成虫,计算减虫率;同时留取肝脏,部分消化后在显微镜下行虫卵计数,计算减卵率,部分肝脏用于组织病理学分析（HE染色法）,观察肝细胞变化及肉芽肿情况。结果:本实验从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出两个DNA片段（SjP14和SjGST基因）,大小分别约1070bp和670bp,并成功地将其克隆入pcDNA3.1⁺载体;将重组质粒pcDNA3.1⁺-SjP14和pcDNA3.1⁺-SjGST进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,分别得到一个大小与PCR扩增产物一致的片段;测序证实均具有完整开放读码框,且为无突变。纯化上述质粒,转染至Hela细胞,经新霉素筛选得出阳性单克隆细胞株,扩大培养。RT-PCR和Western blotting结果显示,两种质粒转染至Hela细胞内均可表达。分别制备无内毒素SjP14和SjGST核酸疫苗,以该疫苗免疫BALB/c小鼠,结果表明:pcDNA3.1⁺-Sj P14核酸疫苗能明显提高小鼠的抗血吸虫感染能力,减虫率和减卵率分别达到44.6%和61.6%;SjP14核酸疫苗与SjGST核酸疫苗联合免疫能进一步提高小鼠抗血吸虫感染作用,减虫率和减卵率分别提高至56.2%和73.5%。大体解剖可见,生理盐水和空质粒组肝脏呈暗褐色,质硬,表面可见弥漫性粟粒样虫卵结节分布,结节隆起密集,体积较大。pcDNA3.1⁺-SjP14组小鼠肝脏色泽略带暗红色,质地较软,表面较光滑,隐约可见少量灰白色小点,虫卵结节较少;SjP14+SjGST核酸疫苗联用组,肝脏颜色呈鲜红色,表面光滑,虫卵结节少,质软。肝组织切片镜下显示,生理盐水和空质粒组小鼠肝组织中可见大量的虫卵肉芽肿形成,肉芽肿体积较大,周围有大量炎细胞浸润,大量的肝细胞变性坏死,pcDNA3.1⁺-SjP14组肝脏病变较生理盐水组明显减轻,pcDNA3.1⁺-SjP14 + pcDNA3.1⁺-SjGST组肝脏损伤程度最轻,肝小叶结构基本完整,虫卵肉芽肿周围炎症反应轻,肉芽肿面积较小。结论:本研究成功地构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1⁺-SjP14和pcDNA3.1⁺-SjGST,且均可在体内外表达,pcDNA3.1⁺-Sj P14核酸疫苗有一定程度的抗血吸虫感染作用, pcDNA3.1⁺-SjP14与pcDNA3.1⁺-SjGST疫苗联合免疫能增强小鼠对血吸虫感染的保。