溶藻弧菌毒力相关基因的检测与保藏方法的研究

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溶藻弧菌对宿主的致病性与溶藻弧菌产生的各种毒力因子息息相关。本研究以溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因(Collagenase)、碱性丝氨酸蛋白酶基因(Alkaline serine exoprotease,AspA)、鞭毛丝蛋白基因(FlaA)、铁摄取调节基因(fur)、毒力调控基因toxR以及toxS作为目的基因,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对不同保藏方法其表达量进行检测。选取实验室保存的8株溶藻弧菌为对象,提取其总RNA为模板,根据GenBank上的全序列设计特异性引物,以16S基因为内参照,研究了collagenase、AspA、FlaA、fur、toxR以及toxS基因的表达量。再分别用这8株菌对罗非鱼进行传统攻毒实验,观测其致死率,分析其毒性强弱。结合两部分研究结果发现,溶藻弧菌的collagenase、AspA、FlaA、toxR以及toxS基因的表达量与溶藻弧菌的毒力具有相关性;而fur基因则与溶藻弧菌的毒力不具有相关性。采用斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、生理盐水保藏法以及甘油液保藏法对实验室同一株溶藻弧菌强毒株进行为期一年的保藏,再用实时荧光定量PCR对其各毒力相关基因的表达量进行检测。分析发现,本研究所采取的四种保藏手法都能较好的保持菌种的存活率以及遗传稳定性,其中斜面低温保藏法效果尤为明显。另外,研究还发现铁摄取调节基因(fur)和毒力调控基因toxS在不同的保藏手法下表达量始终保持相对稳定。本论文的研究成果为探讨溶藻弧菌毒力的荧光定量PCR检测方法的应用奠定了坚实的基础,完善了溶藻弧菌毒力检测的分子手段,有效地提高了溶藻弧菌毒力检测技术的速度与准确性。同时,本文通过对菌种保藏方法的研究,为实验室如何更好地保藏菌种提供了重要的理论指导,为菌种的进一步研究提供优质的实验材料。
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