大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的棉花黄萎病是一种土壤传播的维管束病害,是生产上最重要的病害之一。由于缺乏好的抗源材料与防治药剂,棉花黄萎病防治较为困难。微菌核是黄萎病菌（V.dahliae）在土壤中主要的存活结构和初侵染来源。目前对棉花黄萎病菌的致病及微菌核形成机理的研究不多,分离和鉴定微菌核形成或致病性相关基因,有助于揭示棉花黄萎病病菌致病及微菌核形成机制,进而为棉花黄萎病的防治提供理论依据。本研究在本实验室已构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库的基础上,通过突变表型鉴定和致病性筛选,获得微菌核形成、生长速度、产孢量等培养性状和致病力缺陷的突变体,采用高效TAIL-PCR技术,分离与微菌核形成及致病性降低的黄萎病菌突变体T-DNA插入位点的侧端序列。主要研究结果如下:1.通过菌落形态和微菌核形成能力观察,获得5个在PDA上不产生微菌核的突变体,且气生菌丝较野生型多而浓密,获得15个微菌核产生能力明显减弱的突变体。通过对菌落生长速度的测定获得7个生长速度明显减慢的突变体,7个生长速度明显增加的突变体。2.通过平皿产孢量的测定,筛选出产孢量显著减少的突变体有62个,占总数的21.60%,产孢量显著增加的有7个,占总数的2.44%。进一步利用Czapek液体培养基产孢测定表明,5个菌丝型突变体和突变体V273-2的产孢量较菌株野生型显著的降低,突变体V681-1的产孢量与野生型无显著差异。3.通过苗期分生孢子浸根法测定突变体致病性,筛选出14个致病力减弱的突变体,3个菌丝型突变体和3个微菌核形成减弱突变体的致病力显著减弱,2个菌丝型突变体的致病力与野生型无显著差异。4.对筛选出的3个致病力减弱的突变体和5个不产微菌核突变体,利用高效TAIL-PCR方法对突变体T-DNA插入位点侧端序列进行扩增,通过对目标产物的连接和克隆、测序和序列比对分析,获得了 4个突变体的T-DNA插入位点侧端序列及插入位置基因信息。突变体V229-2-1 T-DNA的右侧端序列长度为343 bp,T-DNA插入位点位于VDAG₀8333.1基因编码区,该基因为假设蛋白基因;该突变体为菌丝型,不产生微菌核,且生长速度大于野生型,产孢量显著减小,致病力与野生型相当。突变体V409-2 T-DNA的右侧端序列长度为422 bp,T-DNA插入位点位于基因VDAG-06398.1编码区中,该基因为假设蛋白基因;该突变体为菌丝型,不产微菌核,生长速度同野生型,产孢量显著减小,致病力显著减弱。突变体V430-2-1 T-DNA的右侧端序列长度为137 bp,T-DNA插入位点距基因VDAG-01383.1（histone acetyltransferase type B subunit 2）下游 54 bp,距基因VDAG-01384.1（5-3.exoribonuclease）上游479 bp;为不产微菌核的菌丝型突变体,产孢量显著减小,致病力明显减弱。突变体V424-2 T-DNA的右侧端序列长度为117 bp,T-DNA插入位点距基因 VDAG-06813.1（two-component syetem protein A）下游 1574 bp;距基因VDAG₀6814.1（假设蛋白基因）上游1729bp;突变体为菌丝型,不产微菌核,产孢量显著降低,致病力减弱。