牡丹(Paeonia suffruticosa),为世界著名的观赏花卉,其花朵硕大、色彩艳丽、芳香四溢,备受人们喜爱。本研究以牡丹叶柄诱导的愈伤组织为材料,进行了牡丹胚性愈伤组织的诱导;克隆牡丹体细胞胚相关SERK基因,并采用实时荧光量PCR技术进行了SERK基因的表达研究;采用农杆菌介导转化法构建了适用于牡丹愈伤组织的遗传转化体系。主要研究结果如下:1.牡丹胚性愈伤组织的诱导本试验选择牡丹‘凤丹白’和‘乌龙捧盛’叶柄诱导的愈伤组织为材料,利用CaCl2、H2O2和硝普纳(SNP,NO供体)进行牡丹胚性愈伤组织的诱导,研究这3种细胞信号转导因子对牡丹愈伤组织生长、分化的影响。通过形态学和显微切片观察,从总体表现来看,‘乌龙捧盛’在愈伤组织生长过程中的褐化程度比‘凤丹白’严重得多,已经影响到愈伤的正常生长和增殖。在不同浓度处理下培养30 d后,愈伤组织的形态上出现了结构变疏松,质地变软,有雪花状和凸起状愈伤组织的形成,这些变化和胚性愈伤组织的形成有关。在这3种因子中,以SNP处理下的变化最显著。通过不同时期内酶活性和内源激素变化的研究发现,CaCl2诱导牡丹胚性愈伤中应保持较高浓度1.6 mmol·L-1以上,诱导时间约在10-20 d;H2O2在牡丹胚性愈伤组织诱导中的作用并不显著;SNP在较低的浓度水平50μmol·L-1以下就可以促进牡丹胚性愈伤的形成,并可能促进体细胞胚的形成。2.牡丹体细胞胚发生相关SERK基因的克隆与表达分析本研究应用同源克隆结合RACE技术首次从牡丹?凤丹白‘叶柄诱导的愈伤组织中成功克隆得到了SERK基因的cDNA全长序列,命名为PsSERK,在GenBank中的注册号为KF876175。该基因的cDNA全长2362 bp,包括299 bp的5非编码区、179 bp的3′非编码区和1884 bp的开放阅读框共编码627个氨基酸。在GenBank中检索发现牡丹PsSERK基因核苷酸序列与其它植物的SERK基因序列高度同源,相似性均在82%以上。对牡丹PsSERK基因的生物信息学分析结果表明,基因编码627个氨基酸,属于亲水性蛋白,定位在细胞膜中,具备跨膜结构,4个保守结构域,24个磷酸化位点,具有信号肽序列,二级结构以α螺旋结构和无规则卷曲结构为主。与不同植物来源的SERK的氨基酸同源性为91%-95%。本研究采用实时荧光定量PCR技术,以Actin作为内参基因分析了在牡丹的叶子、花和胚性愈伤组织中PsSERK基因的转录水平表达变化。结果显示该基因在花中表达量最低,叶子中稍有表达,而在胚性愈伤组织中表达非常高。这表明PsSERK基因的表达与牡丹胚性愈伤的形成密切相关。3.农杆菌介导的牡丹愈伤组织遗传转化体系构建本试验通过农杆菌介导的方法,对牡丹愈伤组织遗传转化体系的优化进行初步的研究。对遗传转化过程中菌株的选择、影响转化率的各项影响因子(预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间等)进行了初步筛选,初步建立植物组织培养液侵染法的牡丹愈伤组织遗传转化体系。潮霉素浓度3 mg·L-1为临界筛选浓度;头孢霉素初始抑菌浓度为200 mg·L-1,在继代培养时降低至100 mg·L-1。不经过预培养,直接用OD600=0.6的菌液侵染20 min,在22℃黑暗环境下共培养3 d,用200 mg·L-1头孢霉素水涮洗浸泡愈伤30 min后,接入含有100mg·L-1头孢霉素的液体增殖培养基,振荡培养24 h后,接至含有100 mg·L-1头孢霉素和3mg·L-1潮霉素的固体筛选培养基中,20 d转接一次。牡丹愈伤组织转化后GUS染色温度为24℃,染色后均能成功检测到GUS瞬时表达活性。