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研究背景：大块骨缺损的修复是骨科医生最常见的遇见的临床问题。近年来，组织工程技术的发展日趋成熟，使骨缺损的修复成为可能。理想的组织工程化骨必需具备以下三要素：种子细胞、细胞因子和支架材料。骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，它在不同的诱导条件下可定向分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。又由于骨髓间充质干细胞相对容易获得，体外培养扩增技术相对较成熟，故而成为骨组织工程中最常用的种子细胞。骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中受到多条信号通路的调节，其中BMP信号通路也是研究最多、最早的一条信号通路。BMPs可通过激活细胞表面的BMP受体来发挥作用，BMPR受体激活后主要通过多种Smads蛋白在细胞内传导效应。目前发现的Smad家族成员至少包括九种蛋白，按功能可分为受体调节Smads（R-Smads， Smad1、2、3、5、8、9）、共同调节Smads（Co-Smads，Smad4）、和抑制性Smads（I-Smads，Smad6、7）。其中I-Smads如Smad6和Smad7对BMP/TGF-信号通路起着负反馈调节作用。研究表明，Smad6和Smad7对TGF-和BMP信号通路的阻断作用具有选择性：Smad7对TGF-和BMP通路均有阻断作用，而Smad6似乎只对BMP信号通路起阻断作用。因此，我们认为内源性的Smad6在骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中起负反馈调节作用。目的：针对大鼠Smad6基因设计、构建并筛选出有效的慢病毒干扰载体；体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞并转染慢病毒干扰载体，观察感染后细胞Smad6基因和蛋白的干扰效率，同时观察Smad6基因抑制后对细胞生物学行为的影响；观察Smad6基因抑制后对骨髓间充质干细胞体外成骨分化的影响；评价Smad6基因干扰后的骨髓间充质干细胞构建的组织工程化骨对大鼠桡骨干缺损的修复效果。方法：（1）Smad6基因干扰慢病毒载体的构建：针对大鼠Smad6基因设计并合成两对特异性干扰片段，连接到pLKO.1质粒中，经大肠杆菌转化后抽取质粒，经琼脂糖电泳和测序鉴定后在HEK-293T细胞内包装慢病毒干扰载体，同时构建阴性对照组慢病毒载体。（2）Smad6基因慢病毒载体的筛选：体外分离扩增大鼠骨髓间充质干细胞，按照梯度稀释法加入不同数量的慢病毒颗粒过夜感染，筛选能够达到有效感染效率（80%以上）的最低病毒量作为下一步的实验条件。按照上述条件以重组慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后，定量PCR和Western-Blot分别检测Smad6基因和蛋白的抑制的效率，观察基因抑制后细胞细胞形态的变化，MTS法绘制细胞的生长曲线。（3）体外成骨分化实验：将细胞分成以下2组： shSmad6组和阴性对照组(NC组)。骨髓间充质干细胞在含有地塞米松、β-甘油磷酸和维生素C的成骨诱导液中诱导培养。检测方法包括：碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶定量检测、茜素红染色、Von Kossa染色、RT-PCR及荧光定量PCR检测成骨相关基因的表达（Runx2、碱性磷酸酶、骨涎蛋白、骨钙素）。(4)基因修饰的骨髓间充质干细胞修复大鼠桡骨骨缺损的研究：30只大鼠分3组：shSmad6+β-TCP组（n=10）、NC+β-TCP组(n=10)、β-TCP (n=10)，观察方法包括：X线观察、HE组织学检查和骨组织形态计量分析。结果：(1)根据大鼠Smad6基因，选择2个靶点，设计并合成了2对shRNA寡核苷酸片段，并成功连接到pLKO.1载体中，经基因测序鉴定插入片段和设计的片段一致。在HEK-293T细胞内包装成慢病毒颗粒。(2)重组慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞后，经荧光定量PCR和Western-Blot检测其内源性的Smad6基因和蛋白的表达明显降低，表明Smad6基因慢病毒干扰载体已成功构建。进一步通过细胞生长曲线和MTS检测发现大鼠骨髓间充质干细胞的Smad6基因干扰后细胞增殖未受明显影响。（3）体外成骨分化实验显示shSmad6组碱性磷酸酶的表达明显高于阴性对照组（p<0.05），shSmad6组钙结节形成的数量明显多于阴性对照组。shSmad6组Runx2、碱性磷酸酶、骨涎蛋白和骨钙素的基因表达也明显高于阴性对照组（p<0.05）。（4）体内修复大鼠桡骨骨缺损的实验：①X线结果：术后12周：shSmad6+β-TCP组中10只有8只完全骨愈合， NC+β-TCP组10只有4只骨愈合，β-TCP组未见明显骨愈合。X线疗效评分结果显示shSmad6+β-TCP组明显高于NC+β-TCP组（P<0.05）；②组织学和组织计量分析结果：术后12周shSmad6+β-TCP组大量的新生骨形成，骨缺损基本完全愈合，NC+β-TCP组新生骨数量比shSmad6+β-TCP组明显少。新生骨小梁面积计量显示shSmad6+β-TCP组较NC+β-TCP组明显增多(P<0.05)。结论：针对大鼠Smad6基因成功设计并构建了重组慢病毒干扰载体，对大鼠骨髓间充质干细胞内源性Smad6基因干扰效率达95%以上；大鼠内源性Smad6基因干扰后体外成骨分化能力显著增加，体内修复骨缺损的作用显著增强。