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本研究分为三部分:
第一部分、Ang II诱导心肌细胞ER stress-CHOP凋亡信号
目的：观察血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)对内质网应激标志蛋白BiP及CHOP蛋白表达变化及其与凋亡的关系，并探讨CHOP反义寡核苷酸(CHOP antisenseoligodeoxynncleotide，CHOP-ODN)对Ang II诱导心肌细胞凋亡的影响。
方法：以体外培养的乳鼠心肌细胞为研究对象。第一部分：Ang II对心肌细胞ERstress及CHOP表达的影响。试验随机分为4组，即正常对照组，100 nmol/L Ang II分别作用6小时，12小时及24小时组。用Western blot检测各组心肌细胞BiP和HCHOP蛋白表达变化。第二部分：内质网应激诱导剂毒胡萝卜素thapsigargin对心肌细胞ER stress及CHOP表达的影响。试验随机分为4组，即正常对照组，2μmol/L thapsigargin分别作用6小时，12小时及24小时组。用Western blot检测各组心肌细胞BiP和HCHOP蛋白表达变化。第三部分：CHOP反义寡核苷酸对Ang II诱导的心肌细胞凋亡的影响。首先确立CHOP反义寡核苷酸转染条件，然后分析CHOP反义寡核苷酸对心肌细胞凋亡的影响。试验随机分为4组。①control：常规心肌细胞培养，不予任何处理；②Ang II：给予100nmol/L Ang II，继续培养24 h；③anti-ODN：CHOP反义寡核苷酸5 mol/L转染24 h后，加入100 nmol/L Ang II，继续培养24 h；④mis-ODN：CHOP错义寡核苷酸5 mol/L转染24 h后，加入100 nmol/LAngII，继续培养24 h。用MTT法检测细胞活力，AnnexinV流式细胞仪检测细胞凋亡率，免疫荧光及Western blot检测CHOP蛋白表达变化。
结果：第一部分：与对照组相比，Ang II呈时间依赖性抑制细胞活力(P<0.01)；Ang II作用6小时后，BiP蛋白表达显著升高(P<0 01)，并于12小时其表达达到峰值(P<0.01)，而24小时后BiP蛋白表达有所回落，但仍显著高于正常对照组(P<0 01)。同时，CHOP在正常对照组表达极低，Ang II作用6小时后，CHOP蛋白表达显著升高(P<0.01)，并持续到本实验的观察终点24小时(P<0.01)。第二部分：thapsigargin呈时间依赖性抑制细胞活力(P<0.01)；BiP及CHOP蛋白表达于thapsigargin作用6小时较正常对照组相比显著升高(P<0.01)，直至持续到24小时(P<0.01)。第三部分：5μmol/L CHOP反义寡核苷酸转染24小时显著抑制Ang II诱导的CHOP高表达(P<0.001)，同时心肌细胞活力降低(P<0.001)，凋亡率减少(P<0.001)。荧光标记示，正常对照组仅见胞浆有微弱的绿色荧光着色；而Ang II处理组，可见CHOP特异性绿色荧光聚集于胞核；CHOP反义寡核苷酸组，绿色荧光染色的胞核数目显著减少。CHOP错义寡核苷酸则对AngII在心肌细胞产生的这些效应均无影响。
结论：ER stress是Ang II诱导心肌细胞凋亡重要途径，CHOP基因缺陷可抑制Ang II诱导的心肌细胞凋亡。
第二部分、ROS/p 38 MAPK介导Ang II诱导心肌细胞凋亡及ER stress
目的：离体观察ROS/p38 MAPK对血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)诱导的心肌细胞凋亡及内质网应激标志蛋白BiP及CHOP表达变化的影响。
方法：以体外培养的乳鼠心肌细胞为研究对象。单用Ang II刺激或预加NADPHoxidase抑制剂apocynin及p38 MAPK抑制剂SB203580干预后，用ROS敏感性荧光探针DCFH-DA进行细胞内活性氧的检测，用MTT法检测细胞活力，Hochest33342染色行细胞凋亡的形态学观察，Annexin V/PI流式细胞仪检测AnnexinV阳性同时PI阴性细胞百分率为细胞凋亡率，Western blot检测BiP、CHOP、p-p38 MAPK及p-PERK变化情况，免疫荧光法检测CHOP表达及定位。
结果：①Ang II在作用24h后，使心肌细胞ROS生成(P<0.05)、BiP及CHOP蛋白表达及细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.01)；②预加apocynin可显著抑制Ang II诱导的ROS聚集，心肌细胞凋亡，BiP及CHOP蛋白高表达(P<0.01)。③预加apocynin显著抑制Ang II诱导的p38 MAPK磷酸化(P<0.001)。与Ang II组相比，p38 MAPK抑制剂SB203580使心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.01)，BiP和CHOP蛋白表达显著降低(P<0.01)，且PERK磷酸化水平显著降低(P<0.01)。
结论：Ang II使细胞内ROS产生增多，活化p38 MAPK，诱发ER stress，及CHOP高表达，最终导致心肌细胞凋亡。
第三部分、CHOP介导Ang II诱导心肌细胞凋亡的下游靶点
目的：观察CHOP反义寡核苷酸对Ang II诱导心肌细胞Bcl-2及Bax蛋白表达的影响，以及对Bax蛋白变构由胞浆转位到线粒体的影响。
方法：以体外培养的乳鼠心肌细胞为研究对象，试验随机分为4组，①control：常规心肌细胞培养，不予任何处理；②Ang II：给予100 nmol/L Ang II，继续培养24 h；③anti-ODN：CHOP反义寡核苷酸5 mol/L转染24 h后，加入100 nmol/LAngII，继续培养24 h；④mis-ODN：CHOP错义寡核苷酸5 mol/L转染24 h后，加入100 nmol/L AngII，继续培养24 h。用Western blot检测Bcl-2，Bax蛋白的总体表达量，以及分别检测Bax蛋白和cytochrome c在胞浆和线粒体的表达变化用，用免疫荧光双标法检测Bax的变构活化及转位。
结果：预先给予5 mol/L CHOP反义寡核苷酸，可显著解除Ang II对Bcl-2蛋白表达的抑制作用(P<0.01)，虽对Bax蛋白表达无显著影响，但Bax/Bcl-2比值显著降低(P<0.01)；给予CHOP错义寡核苷酸mis-ODN则无此作用。与正常对照组相比，Ang II诱导Bax氨基末端暴露并促其由胞浆转位到线粒体(P<0.01)，同时引起cytocbrome c的释放(P<0.01)。而CHOP反义寡核苷酸则显著抑制了Ang II引起的Bax变构(P<0.01)，转位及线粒体cytochrome c的释放(P<0.01)。
结论：Bcl-2，Bax在ERstress介导AngII所致心肌细胞凋亡中作用重大。CHOP高表达可抑制Bcl-2表达，促使Bax转位及cytocbrome c释放并最终导致凋亡。