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目的:基于PINK1/Parkin线粒体自噬通路,以肝郁肾虚型精子活力低下症患者及模型大鼠为研究对象,观察补肾疏肝毓麟汤对精子质量的影响,并进一步研究补肾疏肝毓麟汤改善精子活动力的作用及其机制。方法:1收集2020.12至2021.12月就诊于湖北省中医院凤凰门诊部及湖北中医药大学国医堂门诊部的肾虚肝郁型精子活力低下症患者共90例,采用补肾疏肝毓麟汤进行治疗。治疗以3个月为一疗程,在治疗前后收集精液样本,按照《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)标准进行精子质量检测,分析治疗前后患者的精子质量参数及中医症候评分变化情况并判断疗效。2通过随机数字表法将SD大鼠分为正常组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、五子衍宗丸对照组。采用腺嘌呤灌胃及慢性束缚应激刺激造模3周。正常组与模型组给予等容生理盐水,中药高、低剂量组给药32.4g/kg/d、8.1g/kg/d,五子衍宗丸对照组给药2.6g/kg/d。观察大鼠自发活动状态、行为学表现、生长发育状况、睾丸系数、精子活力变化,透射电镜观察睾丸组织中线粒体自噬的超微结构变化、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒与流式细胞仪检测线粒体膜电位水平变化、免疫荧光标记线粒体外膜易位酶20(TOMM20)与微管相关蛋白1A/1B-轻链3II(LC3II)的共定位、PCR与Western Blot检测睾丸组织PTEN诱导假定激酶1(PINK1)、帕金蛋白(Parkin)、选择性自噬接头蛋白62(P62)、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3II/I)的表达。结果:1临床研究:补肾疏肝毓麟汤治疗精子活力低下症的临床研究。本研究观察期间共脱落11例、剔除3例,最终有效病例76例。以26岁~35岁之间为主,约占总人数的70%,平均年龄为30.58±4.51岁。经治疗3个月后患者的总有效率为79.13%,治愈率为23.68%,显效率为25.00%,好转率为31.58%。与治疗前相比,治疗后患者的PR级精子活力明显提高(P<0.05)、PR+NP级精子活力明显提高(P<0.05)、精子存活率明显提高(P<0.05)、中医症候评分明显降低(P<0.05)。2实验研究2.1补肾疏肝毓麟汤对肾虚肝郁型精子活力低下症模型大鼠的药效观察与正常组相比,模型组大鼠的发育显著减速,体重增长较慢,皮毛光泽度低且易掉落,经常蜷缩状态,较怕冷,睡眠时间增加、大便不成形、饮食量降低、行为活跃度下降的情况,外界刺激时反应灵敏度下降明显等表现。且糖水偏好率降低(P<0.05),旷场实验中进入中央区的次数上明显减少、停留时间增加、总休息时间增加(P<0.05),睾丸湿重及系数减小(P<0.05),精子活动力下降(P<0.05)。与模型组相比,高剂量组、低剂量组、对照组的一般状态均改变明显,发育变快,体重增加,食欲变好,小便量增加,大便不成形缓解明显,行为活动度较前提高,精神状态变好。糖水偏好率升高(P<0.05),旷场实验中进入中央区的次数上明显增加、停留时间减少、总休息时间减少(P<0.05),睾丸湿重及系数增加(P<0.05),精子活动力升高(P<0.05)。与对照组相比,高剂量组、低剂量组的一般状态有所改变,饮食及饮水量较前均增加,活动度较前提高,精神状态稍好。中药高剂量组糖水偏好率升高(P<0.05),进入中央区的次数上明显增加、停留时间减少、总休息时间减少(P<0.05);中药低剂量组进入中央区停留时间减少、总休息时间减少(P<0.05),但在糖水偏好率、进入中央区的次数上无统计学差异(P>0.05)。中药高剂量的睾丸湿重及睾丸系数增加(P<0.05),精子活动力有提高(P<0.05),中药低剂量的睾丸湿重及睾丸系数、精子活动力改变不明显(P>0.05)2.2补肾疏肝毓麟汤通过畅通PINK1/Parkin介导的自噬流改善精子活动力的作用机制研究与正常组相比,模型组的线粒体膜电位比例下降(P<0.05),线粒体超微结构出现核周聚集,嵴受损或丢失,除了碎裂外,还有暗基质,以及外膜不规则,并且受损的线粒体与包括线粒体吞噬体在内的线粒体空泡相关,免疫双染中发现LC3II的存在量明显增多,LC3II与TOMM20的双重标记也增加,自噬相关指标PINK1、Parkin、LC3II/I、P62的基因与蛋白表达增加(P<0.05)。与模型组相比,高剂量组、低剂量组、对照组的线粒体膜电位比例增加(P<0.05),超微结构下正常形态的线粒体比例明显增多,且线粒体溶酶体的数量也减少,免疫双染中发现LC3II的存在量明显减少,LC3II与TOMM20的双重标记减少,自噬相关指标PINK1、Parkin、LC3II/I、P62的基因与蛋白表达减少(P<0.05)。与对照组相比,高剂量组的线粒体膜电位比例增加(P<0.05);高剂量组、低剂量组超微结构下正常形态的线粒体比例明显增多,且线粒体溶酶体的数量也减少,免疫双染中发现LC3II的存在量明显减少,LC3II与TOMM20的双重标记减少,自噬相关指标PINK1、Parkin、LC3II/I、P62的基因与蛋白表达减少(P<0.05)。结论:1.补肾疏肝毓麟汤能提高肾虚肝郁型精子活力低下症患者的PR级精子活动力、PR+NP级精子活动力、精子存活率。验证了补肾疏肝毓麟汤治疗肾虚肝郁型精子活力低下症的有效性。2.补肾疏肝毓麟汤可提高精子活力低下症模型大鼠的精子活动力,促进模型大鼠的生长及生殖系统发育,能改善模型大鼠的肝郁肾虚症状。3.补肾疏肝毓麟汤可提高精子活力低下症模型大鼠的线粒体膜电位水平,可以保护线粒体功能,下调PINK1、Parkin、LC3 II/I、P62的表达,并畅通自噬流,减轻了线粒体的过度自噬。这可能是补肾疏肝毓麟汤发挥治疗作用的关键点之一。