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研究背景及目的:晚期直肠癌预后不佳。肿瘤的免疫逃逸机制在其进展和转移中发挥重要作用。PD-L1和LAG-3等多种免疫检查点分子参与了肿瘤逃逸机制。现已发现PD-L1和LAG-3表达于多种肿瘤微环境中,阻断它们可起到协同抗肿瘤作用。本研究将分析直肠癌免疫微环境中PD-L1和LAG-3的表达情况,探讨他们在直肠癌逃逸中的作用,以及在直肠癌模型上验证联合阻断的抗肿瘤效果,为临床治疗提供参考。方法:1、收集未进行术前治疗且有淋巴细胞浸润的上段直肠癌标本。通过免疫荧光方法检测癌组织中的PD-L1和肿瘤浸润淋巴细胞上LAG-3表达情况,分析这些因素与临床预后指标的相关性以及意义;然后用免疫组化检测肿瘤PI3K、AKT因子的上调水平,了解肠癌肿瘤细胞增殖情况;再将PD-L1、LAG-3与PI3K、AKT的表达情况进行相关性分析,了解这两个免疫检查点对于肿瘤增殖的影响,探讨PD-L1和LAG-3在免疫逃逸中可能的机制。2、先利用慢病毒沉默技术构建PD-L1沉默慢病毒并转染CT26直肠癌细胞,检测其沉默效果;然后把该细胞皮下注射C57BL/6小鼠建立肿瘤模型,分成PD-L1沉默慢病毒组(接种PD-L1沉默慢病毒转染的CT26细胞);PD-L1空载组(接种PD-L1空载慢病毒转染的CT26细胞);空白组(接种正常培养的CT26细)。成瘤后均给予LAG-3抗体干预。观察肿瘤重量和体积,绘制生长曲线。5周后处死小鼠。利用HE染色检测各组瘤体的病理变化,TUNEL检测肿瘤细胞凋亡,流式和MTT分别检测各组CD4+T、CD8+T细胞的增殖和活性水平;免疫荧光检测各组肿瘤PD-L1和LAG-3的表达;Real-time PCR和Western blot检测各组肿瘤PD-L1、PI3K、AKT表达。结果:1、57例直肠癌标本中,PD-L1阳性42例,阳性率为73.7%;LAG-3阳性24例,阳性率为42.1%;PD-L1和LAG-3双阳性16例,双阳性率为28.1%。癌组织中有大量的PD-L1的表达,LAG-3在癌细胞旁的浸润淋巴细胞上分表达。与癌旁组织相比,癌组织的PD-L1和LAG-3的表达明显较高,差异具有统计学意义(P<0.05)。2、生存分析显示,在无瘤生存率上,PD-L1阳性组与阴性组相当,差异无统计学意义(P>0.05)。LAG-3阳性组与阴性组相当,差异无统计学意义(P>0.05)。PD-L1和LAG-3双阳性组与非双阳性组相当,差异无统计学意义(P>0.05)。提示PD-L1和LAG-3表达的预后意义不显著。3、16例PD-L1和LAG-3双阳性的直肠癌标本均可检测到PI3K和AKT表达。与癌旁组织相比,癌组织的AKT1和PI3K的表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。提示PI3K和AKT反映可肿瘤增殖状况。4、直肠癌组织上PI3K、AKT的表达水平分别与PD-L1、LAG-3表达水平具有相关性(P<0.05)。说明PD-L1和LAG-3与肿瘤生长相关。5、Real-time PCR和Western-blot显示转染PD-L1沉默慢病毒的CT26细胞其PD-L1表达明显低于空白组和空载组,差异有统计学意义(P<0.05)。说明CT26细胞转染慢病毒后PD-L1表达被有效沉默。6、免疫荧光、Real-time PCR和Western-blot下PD-L1慢病毒组对比空白组和空载组,肿瘤组织上PD-L1的表达明显较少,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明肿瘤组织上PD-L1表达被有效抑制。7、在接受LAG-3抗体干预后,PD-L1慢病毒组小鼠种植肿瘤的重量和体积小于空白组和空载组,差异具有统计学意义(P<0.05)。8、HE染色显示PD-L1慢病毒组肿瘤细胞排列疏松,细胞生长不活跃;空白组的肿瘤组织和空载组肿瘤组织中血管分布丰富,肿瘤细胞排列紧密,瘤细胞生长活跃,大小相对一致,说明PD-L1联合LAG-3双阻断组肿瘤细胞增生受限。9、Real-time PCR和Western-blot显示,与空白组和空载相比,PD-L1沉默慢病毒组的PI3K、AKT的表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。说明PD-L1和LAG-3联合断组比LAG-3阻断组肿瘤生长抑制更显著。10、Tunel检测发现,PD-L1慢病毒组肿瘤细胞凋亡比其他两组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明双检查点阻断比LAG-3单阻断对肿瘤抑制更显著。11、用流式检测显示,PD-L1慢病毒组对比空白组和空载组,小鼠肿瘤微环境中的CD4+T细胞和CD8+T细胞明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。说明双阻断组促进T细胞增殖。12、MTT显示,PD-L1慢病毒组对比空白组和空载组,肿瘤微环境中的CD8+T细胞和CD4+T细胞活性明显较高,差异有统计学意义(P<0.05)。说明双阻断提高了T细胞的活性。结论:直肠癌微环境中可出现PD-L1和LAG-3共同表达。这两个检查点与肿瘤免疫逃逸相关。双检查点联合阻断不仅有效提高微环境中T细胞的数量和功能,而且能够协同抑制肿瘤细胞生长。PD-L1联合LAG-3双检查点联合阻断方案有望成为直肠癌免疫治疗的新希望。