论文部分内容阅读
癌症的靶向基因-病毒治疗策略(Cancer Targeting Gene-ViroTherapy,简称CTGVT)即把基因治疗与病毒治疗二者结合起来。它是癌症治疗新策略,溶瘤病毒能在靶向的肿瘤细胞内特异性增殖数百倍,插入其中的的抗癌基因也相应地复制上升数百倍,故对肿瘤细胞产生强烈的杀伤作用,从而大大提高CTGVT的抗癌效果。痘苗病毒具有以下特点：安全性高,复制快,基因组容量大,稳定性高且可以通过静脉注射进行体内注射。基于以上特点,痘苗病毒可以作为一种理想的病毒载体应用与癌症的治疗之中。IL-24是一种新型的细胞因子,可以直接或是激活caspase从而诱导癌细胞的凋亡,在基因治疗领域成为明星基因且ING241(Ad-IL-24)目前进入临床2期。Smac基因是一种凋亡诱导因子,在细胞受到刺激或是影响时,从线粒体中与细胞色素C一同释放出来。它可以与IAP家族成员结合从而诱导癌细胞的凋亡,抑制细胞的生长。IL-24和Smac是靶向癌症的多基因治疗中重要的候选基因,除此之外,在构建IL-24和Smac双基因表达载体过程中,选择稳定高效的连接子也非常关键。因此,本文首先选用三种不同的连接子多肽IETD、EEED、F2A构建三个真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24-IETD-Smac质粒,pcDNA3.1(+)-IL-24-EEED-Smac质粒和pcDNA3.1(+)-IL-24-F2A-Smac质粒,并联合5-氟尿嘧啶(5-FU)处理研究各连接子介导的融合蛋白的剪切效果。实验结果表明,在三种IL-24-linker-Smac双基因表达载体中,F2A连接子的剪切效果优于IETD/EEED连接子。基于以上实验结果,我们选用F2A连接子多肽来连接IL-24和Smac基因并结合痘苗病毒载体构建成重组溶瘤痘苗病毒即OncoPox IL-24-F2A-SMAC和OncoPox-SMAC-F2A-IL-24。并在细胞水平上,利用Western Blot技术,检测到双基因及其对照组重组溶瘤痘苗病毒中目的基因都可以正常的进行蛋白表达；通过MTT手段初步检测,结果表明双基因溶瘤痘苗病毒OncoPox-IL-24-F2A-SMAC和OncoPox-SMAC-F2A-IL-24较单基因对照病毒有更好的肿瘤杀伤效果。这也为痘苗病毒载体在癌症治疗以及双基因治疗中的提高了参考。